Tiermodelle der Molybdän-Cofaktor-Defizienz und ihre Therapie

Die Molybdän-Cofaktor (MoCo) -Defizienz ist eine autosomal rezessiv vererbte Krankheit. An der MoCo-Biosynthese beim Menschen sind verschiedene Enzyme beteiligt, die von den Genen MOCS1, MOCS2, MOCS3 und GEPH kodiert werden. Mutationen im MoCo-Biosyntheseweg führen zum Verlust der MoCo-abhängigen Enzyme Sulfitoxidase, Xanthindehydrogenase und Aldehydoxidase. Der Verlust dieser Enzymaktivitäten hat hauptsächlich schwere neuronale Schäden zur Folge und die meisten MoCo-defizienten Patienten sterben im frühen Kindesalter. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit dem Mocs1-Knockout-Modell für die MoCo-Defizienz Typ A mit Mutationen im MOCS1-Gen, um bisher bekannte Behandlungsmöglichkeiten zu verbessern bzw. neue Therapiemöglichkeiten zu finden. In den vergangen Jahren konnte eine Substitutionstherapie mit zyklischem Pyranopterinmonophosphat (cPMP), dem ersten Zwischenprodukt der MoCo-Biosynthese, etabliert werden. Mocs1-defiziente Mäuse sterben spätestens 12 d nach der Geburt mit einer durchschnittlichen Lebensdauer von 7.5 d. Die intrahepatische cPMP-Behandlung konnte den Phänotyp der MoCo-Defizienz erheblich verbessern, so dass die behandelten Mäuse ein durchschnittliches Alter von 91.8 d erreichten und fertil waren. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten cPMP-Dosis-Bestimmungen führten zu einer weiteren Verlängerung der Lebensdauer der behandelten Mäuse auf durchschnittlich 160 d. Außerdem wurde die orale Gabe als eine neue Applikationsform des cPMPs untersucht. Eine Alternative zur cPMP-Substitutionstherapie eröffnete sich mit der Identifizierung und biochemischen Charakterisierung der pflanzlichen Sulfitoxidase (PSO) aus Arabidopsis thaliana, deren Fähigkeit die murine MoCo-Biosynthese zu restaurieren im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde. Zwar wurde eine Verlängerung der Lebensdauer erreicht, jedoch traten schwere Nebenwirkungen auf, die vermutlich auf die Bildung von H2O2, ein Nebenprodukt der Detoxifizierung der PSO, zurückzuführen ist. Sie hatte den Tod der behandelten Mäuse zur Folge. Auch eine Injektion von embryonalen Hepatozyten in das Lebergewebe Mocs1-defizienter Mäuse konnte den Phänotyp der MoCo-Defizienz nicht verbessern. Des Weiteren wurde die somatische Gentherapie für die Behandlung der MoCo-Defizienz Typ A in Betracht gezogen. Einerseits wurde untersucht, inwieweit die Verwendung von Atellocollagen als Trägermaterial von Plasmid-DNA sich auf die Transfektionsrate im Rahmen des nichtviralen Gentransfers auswirkt. Anderseits sollten virale Vektoren genutzt werden, um das intakte MOCS1-Gen in Mocs1-defiziente Mäuse einzubringen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Langzeitexpression verschiedener Expressionskassetten nachgewiesen werden, die mit Hilfe eines rekombinanten Adeno-assoziierten Vektor (rAAV) des chimären Serotyp 1/2 eingebracht wurden. Neben dem Vergleich verschiedener Applikationswege und Injektionszeitpunkte wurde auch die notwendige Dosis für die Aufhebung des Phänotyps der MoCo-Defizienz bestimmt. Außerdem wurde die Wirkung von zwei- und dreifachen Injektionen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Geburt von Mäusen untersucht. Dabei wurde ein kurzes neonatales Zeitfenster gezeigt, in dem das Immunsystem nicht auf den eingebrachten Vektor reagierte. Die Exposition mit dem rAAV-Capsid innerhalb dieses Fensters erlaubte die transgene Expression nach einer erneuten rAAV-Transduktion zu einem späteren Zeitpunkt. Dreifach-Injektionen des rAAV zeigten jedoch, dass außerhalb dieses Zeitfensters nicht mehr als eine Applikation des rAAVs möglich war, was gegen eine Ausbildung einer Immuntoleranz gegenüber dem viralen Capsid spricht. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Molybdän-Cofaktor-Defizienz Typ B. Im Falle des humanen MOCS2-Gens wurde eine neue Spleißform beschrieben, welches ein bis dahin unbeschriebenes Exon enthält. Der experimentelle Nachweis der Spleißform III im Rahmen dieser Arbeit zeigte, dass MOCS2B nicht durch leaky scanning translatiert wird, sondern dass durch das neue Transkript das MOCS2A-Startcodon umgangen und die Translation beim MOCS2B-Startcodon initiiert wird. Studien an Patientenfibroblasten mit Mutationen in diesem Abschnitt der MoCo-Biosynthese zeigten, dass MOCS2B nur zusammen mit MOCS2A stabil vorliegen kann. Weiterhin wurden die genomische Struktur des murinen Mocs2-Gens und dessen Transkripte untersucht. Diese Analysen gaben neue Hinweise auf die Bildung der Untereinheiten der Molybdopterinsynthase