Untersuchungen basaler Transkriptionsfaktoren im Infektionsverlauf großer DNA-Viren

Das zentrale Interesse dieser Studien bestand darin, den Einfluss der Infektion großer DNA-Viren auf den basalen Transkriptionsapparat der Wirtszellen zu untersuchen. Die frühe Genexpression des Baculovirus AcMNPV erfolgt durch die zelluläre RNAP II. Die späten und die hyperexprimierten sehr späten viralen Gene werden hingegen durch eine viruskodierte RNA-Polymerase transkribiert. Es wird angenommen, dass der basale zelluläre Transkriptionsfaktor TBP in der frühen baculoviralen Transkription involviert ist, wohingegen eine Beteiligung von TBP an der späten Infektion unbekannt ist. Expressionsanalysen zeigten einen signifikanten Anstieg der TBP-Proteinmenge in der späten AcMNPV-Infektionsphase, der im Gegensatz zur beschriebenen virusinduzierten Abnahme der zellulären Genexpression stand. Somit ergab sich die Frage, wie der TBP-Anstieg durch das Virus induziert wird, und welche Bedeutung er für die Infektion hat. Nach Hemmung der Translation konnte eine hohe Stabilität von TBP nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu steht ein plötzlicher Abfall der gestiegenen TBP-Menge in infizierten TN-368-Zellen, so dass ein aktiver virusinduzierter Abbaumechanismus von TBP möglich ist. In Lokalisierungsstudien konnte kein direkter Zusammenhang dieses TBP-Abbaus mit dem Ubiquitin-Proteasomen-Weg hergestellt werden. In der ebenfalls permissiven Zelllinie Sf21 wurde der Abfall der TBP-Proteinmenge nicht beobachtet. Lokalisierungsstudien zeigten eine TBP-Relokalisierung von einem granulären Färbemuster im gesamten Zellkern in distinkte Kerndomänen ab der frühen Infektionsphase. Diese Kernstrukturen kolokalisierten mit viralen Replikationszentren und nahmen simultan und in Abhängigkeit von den Orten der viralen DNA-Synthese an Größe zu. In RNA-Interferenzstudien zur Analyse der Bedeutung der Baculovirus-induzierten TBP-Zunahme konnte die TBP-Proteinmenge nur in uninfizierten Zellen reduziert werden, nicht aber in der späten Infektionsphase. Die vergleichsweise durchgeführten Reduktionen der viralen Transkriptions- und Replikationsfaktoren IE2, DBP und LEF-4 zeigten keine Wirkungen auf die Expression der frühen viralen Proteine und von TBP. Nach der Blockierung von DBP konnte in der späten Phase der Infektion eine signifikante Erhöhung der Proteinmengen von viralen LEF-Proteinen beobachtet werden, die jedoch keinen messbaren Effekt auf die Synthese viraler Strukturproteine oder auf die Bildung von Virus-Polyedern hatte. Die Hemmung der postulierten RNA-Polymerase-Untereinheit LEF-4 führte zum Verlust der späten und sehr späten viralen Strukturproteinsynthese und der Virusproduktion. Vergleichsanalysen während der HSV-1-Infektion, in der ausschließlich die Wirts-RNAP II für die virale Transkription genutzt wird, zeigten keinen signifikanten Einfluss auf die Expression von TFIID-Komponenten. In Lokalisierungsstudien konnten die RNAP II und die TFIID-Untereinheiten TBP, TAF1 und TAF4 ab der frühen Phase der Infektion in distinkten Kerndomänen beobachtet werden, die mit Orten der viralen DNA-Synthese kolokalisierten. Die initiale Relokalisierung der basalen Transkriptionsfaktoren in Präreplikationszentren schien unabhängig von replizierender viraler DNA stattzufinden, wohingegen die Größenzunahme der Kernstrukturen in Abhängigkeit von viralen DNA-Replikationszentren geschah. Diese Daten zeigen erstmals eine Zunahme des TBP-Proteins in der späten Baculovirus-Infektionsphase und deuten damit auf eine Beteiligung von TBP an der Hyperexpression der sehr späten viralen Faktoren hin. In einem offenbar konservierten Mechanismus im Infektionsverlauf großer DNA-Viren findet die virale Transkription an Orten der viralen DNA-Synthese durch Rekrutierung von TFIID-Untereinheiten statt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die freigesetzten Virusgenome direkt für die Transkription zugänglich sind, so dass basale Transkriptionsfaktoren in Replikationszentren rekrutiert werden