Charakterisierung von NUANCE, einem Protein der alpha-Aktinin Superfamilie

NUANCE ist ein Protein der a-Aktinin Superfamilie, das eine Aktin-Bindungs-Domäne, 22 Spektrin-Domänen und eine Transmembran-Domäne enthält. Das NUANCE Gen erstreckt sich über eine Länge von 373 kb auf dem humanen Chromosom 14. Die cDNA ist 21,8 kb lang und kodiert für ein Protein mit einer Masse von 789 kDa. Durch selektive Permeabilisierungstechniken und Immunfluoreszenzstudien auf subzellulärer Ebene konnte gezeigt werden, dass NUANCE auf der äußeren Kernmembran, im Nucleoplasma und in Kern-nahen Bereichen lokalisiert ist. Eine Untersuchung der Aktin-Bindungs-Domäne offenbarte, dass NUANCE F-Aktin in vitro binden kann. Dabei zeigte das Fusionsprotein 6xHis-ABD eine Bündelungsaktivität und eine Steigerung der Polymerisationsrate von F-Aktin. Die ermittelte Dissoziationskonstante Kd = 3,8 ± 1 µM von 6xHis-ABD zu F-Aktin liegt in derselben Größenordnung wie die des nahe verwandten Proteins Enaptin. Durch den Einsatz des �Yeast Two-Hybrid�-Systems konnte eine direkte Interaktion von NUANCE und Lamin A festgestellt werden. Ferner war NUANCE nach einem �Knockdown� von Lamin A/C mit Hilfe von RNAi nicht mehr in der Kernmembran lokalisiert. Eine Zerstörung des Lamin A/C Netzwerks durch eine dominant-negative GFP-Lamin B-Form hatte ebenfalls eine Miss-Lokalisation von NUANCE zur Folge. Bindungsanalysen zeigten eine direkte Interaktion von NUANCE mit einem gemeinsamen Bereich von Lamin A und C. Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass NUANCE mit Lamin A/C auch in vivo interagieren kann. Eine Untersuchung der hoch konservierten Klarsicht-Domäne mit Hilfe von GFP-Fusionsproteinen zeigte, dass diese Domäne für eine Kernmembranlokalisation ausreichend ist und die Fusionsproteine endogenes NUANCE verdrängen können. Bindungsanalysen des lumenalen Bereichs von NUANCE und SUN1/UNC84 zeigten eine direkte Interaktion der beiden Proteine. Eine Miss-Lokalisation von Emerin konnte durch einen �Knockdown� von NUANCE mit Hilfe von RNAi gezeigt werden. Die Expression von C-terminalen GFP-Fusionsproteinen, die nur die Transmembran-Domäne und den lumenalen Bereich enthalten, hatte ebenfalls eine Miss-Lokalisation von Emerin zur Folge. NUANCE gehört mit Enaptin zu den ersten Proteinen der a-Aktinin Superfamilie, die die potentielle Fähigkeit besitzt, das Aktin-Cytoskelett mit dem Zellkern zu verbinden und aufgrund ihrer Interaktionen mit Emerin, Lamin A/C und SUN1/UNC84 eine Organisatorrolle am Zellkern übernehmen können. Die Interaktionen mit Lamin A/C und Emerin lassen vermuten, dass Mutationen innerhalb des NUANCE Proteins für Muskeldystrophien und Laminopathien verantwortlich sein könnten