Cistatinas de cebada: proteínas de defensa contra artrópodos

Las cistatinas son un grupo de proteínas identificadas en animales, plantas y algunos microorganismos que inhiben cisteín proteasas C1A, de la familia de la papaína. Las cistatinas de plantas o fitocistatinas tienen un papel endógeno relacionado con el intercambio proteico y la muerte celular programada y se ha demostrado que actúan como proteínas de defensa frente a plagas y patógenos. En cebada, Hordeum vulgare L., se ha identificado la familia completa de cistatinas compuesta por trece miembros, HvCPI-1 a 13. Siete de ellos habían sido previamente caracterizados. En este trabajo se ha completado la caracterización de todos los miembros de esta familia de cistatinas y se ha evaluado su actividad frente a artrópodos plaga. Todas las cistatinas de cebada mantienen conservados el motivo LARFAV, exclusivo de vegetales, y los tres motivos implicados en la unión enzima-inhibidor, aunque en algunos casos con pequeñas variaciones. Además, se ha determinado que la cistatina HvCPI-4 posee una extensión carboxilo terminal con un motivo conservado implicado en la inhibición de cisteín proteasas C13 de la familia de legumaínas. Las estructuras tridimensionales de las cistatinas, se han modelizado a partir de la estructura cristalizada de la orizacistatina I de arroz. Los patrones de expresión obtenidos mediante RT-qPCR han indicado que las cistatinas se expresan principalmente en semilla aunque sus mensajeros también se acumulan en hojas y raíces. Además, se ha determinado la localización subcelular de las trece cistatinas, básicamente detectada en el retículo endoplásmico y el aparato de Golgi, aunque la cistatina HvCPI-4 aparece también en el núcleo y la HvCPI-1 en el núcleo y el citoplasma. Ensayos de inhibición in vitro frente a cisteín proteasas comerciales tipo catepsina B, H, L y legumaína han mostrado una capacidad inhibitoria diferencial y específica dentro de la familia de cistatinas de cebada. En relación con su función de defensa, se han estudiado los efectos de las 13 cistatinas sobre diferentes especies de artrópodos cuyos enzimas digestivos más abundantes son de tipo cisteín proteasa, dianas potenciales de las cistatinas. Concretamente, se han seleccionado: el escarabajo de la patata, Leptinotarsa decemlineata (Say) y su depredador natural, Podisus maculiventris (Say), la crisomela del maíz, Diabrotica virgifera (LeConte), el ácaro, Tetranychus urticae Koch y dos pulgones, Myzus persicae (Sulzer) y Acyrthosiphon pisum (Harris). Las proteasas digestivas del ácaro y de los pulgones no se conocían de forma detallada, por lo que se ha realizado una caracterización enzimática de estas especies. En todas ellas se ha detectado la presencia de catepsinas L y B y leucin aminopeptidasa pero además, en el caso del ácaro y del pulgón M. persicae se ha detectado también actividad catepsina D y en el caso del pulgón A. pisum se ha detectado actividad carboxipeptidasa. En ninguno de los casos se ha detectado actividad serín proteasa. Se ha determinado la capacidad inhibitoria in vitro de las 13 cistatinas frente a la actividad catepsina L y catepsina B presente en extractos proteicos de estos seis artrópodos, utilizando substratos específicos. Las cistatinas han mostrado diferente especificidad por la actividad de los artrópodos aunque, en general, todas son mejores inhibidores de su actividad tipo catepsina L. La cistatina HvCPI-6 ha resultado ser el inhibidor más potente y ha sido seleccionado para realizar ensayos in vivo con 3 de los artrópodos anteriormente mencionados: T. urticae, M. persicae y A. pisum. Para estudiar la toxicidad en pulgones, se han preparado dietas artificiales suplementadas con cistatina HvCPI-6 y se han analizado la mortalidad y las alteraciones en sus proteasas digestivas. En el caso de A. pisum la ingestión de la cistatina en altas concentraciones provoca la muerte del insecto, muerte que esta asociada a la inhibición de cisteín proteasas digestivas. Por el contrario, en M. persicae no se observa mortalidad a ninguna de las dosis ensayadas, lo que parece estar relacionada con la sobreproducción de proteasas digestivas. Además, se han generado plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana (L.) Heyn, que expresan la cistatina HvCPI-6, para estudiar el efecto que produce sobre M. persicae. Pulgones alimentados con las plantas transgénicas han mostrado un retraso en el desarrollo aunque no se han observado alteraciones en la descendencia. Dado que A. pisum no se alimenta de plantas de arabidopsis, se han realizado bioensayos combinados dieta/plantas de haba para estudiar los efectos de la cistatina sobre el desarrollo y la descendencia de este pulgón. Igual que en el caso de M. persicae se ha observado un retraso en el desarrollo, pero no hay modificaciones en la descendencia. El objetivo final de la utilización de la cistatina como transgen es la obtención de variedades agrícolas más protegidas frente al ataque de plagas y enfermedades. Con este propósito se han generado plantas transgénicas de maíz, Zea mays L., que expresan la cistatina HvCPI-6. Mediante bioensayos se ha podido determinar que la expresión de la cistatina en plantas provoca un retraso en el desarrollo de los ácaros que se han alimentado de las plantas transgénicas, que se correlaciona con una disminución de la actividad tipo catepsina B. Los resultados anteriores, indican que las cistatinas de cebada y en particular la cistatina HvCPI-6, suponen una vía alternativa para el control de plagas y que un estudio exhaustivo de las mismas permitiría considerar la expresión piramidal (“gene pyramiding”) de los genes que codifican estos inhibidores junto con otros genes con carácter insecticida, para aumentar la resistencia de las plantas al ataque de artrópodos y evitar la adaptación de los mismos. SUMMARY Cystatins are a group of proteins identified in animals, plants and microorganisms that inhibit cysteine proteases C1A from the papain family. Plant cystatins or phytocystatins have an endogenous function related with the protein turnover and the programmed cell death and it has been demonstrated that they have a defence role against pests ad pathogens. In barley, Hordeum vulgare L., it has been identified the whole family of cystatins which includes 13 members, HvCPI-1 to 13. Seven of these members had been previously characterized. In this work, the characterization of all the members of this family has been completed and it has been also evaluated their activity against arthropods. All barley cystatins have the motif LARFAV, specific from plants, and three conserved motifs involved in the enzyme-inhibitor interaction, although in some cases show little variations. It has been also determined that the cystatin HvCPI-4 has a carboxy terminal extensión, with a conserved motif involved in the inhibition of the cysteine proteases C13 of the legumain family. The tridimensional structures of the thirteen cystatins have been modelized from the crystalized structure of the oryzacystatin I from rice. Expression patterns obtained from RT-qPCR have indicated that barley cystatins are expressed mainly on seeds, although their messengers are also acumulated in leaves and roots. Moreover, the subcellular localization of the thirteen cystatins has been analysed. Basically, they have been detected in the endoplasmatic reticulum and Golgi apparatus, with the exception of the cystatin HvCPI-4 which appears also in the nucleus and the HvCPI-1 cystatin which has been localized in the nucleus and the cytoplasm. In vitro inhibition assays against commercial cysteine proteases: cathepsin B-, L-, H-like and legumain have demonstrated a differencial and specific inhibitory capacity within the family of barley cystatins. The defence function has been studied analysing the effects of the 13 cystatins against different species of arthropods which their digestive enzymes are mainly cysteine proteases. It has been selected: the Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata (Say) and its natural predator Podisus maculiventris (Say), the western corn rootworm Diabrotica virgifera (LeConte), the two-spotted spider mite Tetranychus urticae Koch and two aphids, Myzus persicae (Sulzer) and Acyrthosiphon pisum (Harris). It has been determined in detail the enzymatic characterization of the mite and the two aphids unknown up to know. In all of them, the presence of cathepsin L- and Blike and leucine aminopeptidase activities has been detected. Moreover, cathepsin D activity was also found in the mite and in the aphid M. persicae and carboxipeptidase activity in the aphid A. pisum. Serine proteases have not been detected in any of them. The in vitro inhibitory capacity of the 13 cystatins has been determined against protein extracts from the six arthropods. Cystatins have resulted better inhibitors of cathepsin L-like activity than B-like activity. The cystatin HvCPI-6 has been the strongest inhibitor of protein extracts derived from all the arthropods tested, and it has been selected to do in vivo assays with T. urticae, M. persicae y A. pisum. To study the effects on both aphids, artificial diets supplemented with the HvCPI-6 protein have been prepared. In the case of A. pisum, the ingestion of the cystatin at high concentration has provoked the death of the insect. This death can be associated to the inhibition of its cysteine proteases. On the contrary, it has not been observed any mortality of M. persicae fed with the HvCPI-6 diet. Transgenic plants of Arabidopsis thaliana (L.) Heyn expressing the HvCPI-6 cystatin have been generated to study their effects on M. persicae. Aphids fed on transgenic plants suffered a delay on their development but no alterations in their fecundity were observed. Since A. pisum does not fed on arabidopsis, combined assays using artificial diet and bean plants have been done to study the effects of the cystatin HvCPI-6 on this aphid. A delay in its development was observed but no alterations in its fecundity were detected. The final aim of the use of the cystatin as a transgen is to obtain crop varieties more protected against pests and pathogens. With this purpose transgenic plants of maize, Zea mays L., expressing the HvCPI-6 cystatin were developed to perform bioassays with mites. Again, a delay on the development of mites fed on the transgenic plants was detected. This delay has been related with a reduction in the cathepsin B-like activity. All these results indicate that barley cystatins, and particularly the HvCPI-6 cystatin, suppose and alternative for pest control. A gene pyramiding approach using cystatins together with other insecticidal genes could be considered to overcome arthropod adaptation and to get pest resistant plants