Analisi della variabilità genetica al locus della Stearoyl-CoA Desaturasi (SCD) nella Bufala Mediterranea Italiana

La composizione degli acidi grassi del latte è il risultato della combinazione di fattori esogeni ed endogeni. I primi sono rappresentati principalmente dal tipo di alimentazione e dal sistema di gestione aziendale condotti dall’allevatore. Quelli endogeni, invece, dipendono dall’attività degli enzimi lipogenici attivi a livello della ghiandola mammaria. La Stearoyl-CoA Desaturasi (SCD) è un enzima chiave nel metabolismo degli acidi grassi monoinsaturi (MUFA) in quanto catalizza l’inserzione di un doppio legame in posizione cis-Δ9 in un largo spettro di acidi grassi a media e lunga catena. I substrati dell’enzima sono molteplici, ma quelli che manifestano una maggiore specificità sono l’acido palmitico e l’acido stearico, i quali sono convertiti rispettivamente in acido palmitoleico ed acido oleico, i composti maggiormente rappresentati nei fosfolipidi di membrana. Per questo motivo, la SCD è responsabile del rapporto acidi grassi saturi/insaturi nella composizione dei trigliceridi e della membrana fosfolipidica e svolge un ruolo determinante nel definire la fluidità delle membrane cellulari e regolare le interazioni tra due cellule contigue. La ghiandola mammaria è l’organo di maggiore espressione della SCD nei ruminanti in lattazione. Subito dopo il parto, si nota una riduzione dell’attività desaturasica a livello del tessuto adiposo, sito di maggiore attività di questo enzima, ed un incremento parallelo a livello della ghiandola mammaria. L’attività della SCD può essere stimata sulla base del rapporto tra il prodotto e il substrato dell’enzima stesso ed, in particolare, può essere ritenuto il migliore indicatore dell’attività desaturasica il rapporto acido miristoleico/miristico (C14:1/C14), poiché entrambi vengono sintetizzati completamente a livello della ghiandola mammaria. Il gene SCD è stato indicato come gene candidato nel cambiamento del rapporto acidi grassi saturi/ insaturi e può, pertanto, influenzare la qualità del grasso nel latte e nelle carcasse. La prima sequenza nucleotidica di SCD ad essere descritta fu quella del cDNA di topo in cui sono state isolate due sequenze di mRNA, chiamate rispettivamente SCD1 e SCD2. Tra gli animali di interesse zootecnico sono state sequenziate le SCD di bovino (gene completo; Medrano et al., 2003), di ovino (cDNA completo; Ward et al., 1998) di capra (cDNA parziale; Bernard et al., 2001), di suino (cDNA completo; Ren et al., 2004) e di pollo (cDNA completo; Lefevre et al., 2001). Nel bovino, il gene SCD mappa sul cromosoma 26, si estende su un tratto di DNA di 17,088 Kb ed è organizzato in 6 esoni e 5 introni. La sequenza del completo mRNA bovino è di 5.108 Kb così divisi: 144 bp della regione 5’UTR, 1080 bp della ORF (Open Reading Frame) e 3884 bp della regione 3’UTR. Ad oggi, nel bovino sono stati identificati 8 SNP, di cui tre localizzati sul quinto esone. Di questi tre, i primi due polimorfismi non comportano sostituzioni aminoacidiche nella sequenza proteica, mentre il terzo, rappresentato da una transizione T→C al 231° nucleotide del quinto esone, è responsabile del cambiamento aminoacidico Val→Ala. L’allele C è stato relazionato ad un più alto contenuto di MUFA nelle carcasse e sembrerebbe essere positivamente correlato ad un più elevato indice di desaturazione nel latte, misurato come rapporto C18:0/C18:1 e C16:0/C16:1. E stato visto che i tre SNP individuati a livello del 5° esone vengono ereditati insieme, pertanto vanno a costituire due aplotipi distinti, A e V. Per la bufala Mediterranea Italiana sono disponibili poche informazioni riguardo il gene SCD ed in banca dati è stato possibile reperire solo le sequenze relative al 4°, 5° e parte del 6° esone del gene. Lo scopo del presente lavoro è studiare la struttura del gene della Stearoyl-CoA Desaturasi (SCD) in Bubalus bubalis ed analizzare la variabilità genetica a tale locus attraverso l’individuazione di marcatori molecolari. A tal fine, utilizzando l’mRNA estratto dalle cellule somatiche del latte di una bufala di razza Mediterranea Italiana allevata nella provincia di Salerno, sono stati isolati e sequenziati tre diversi trascritti di dimensioni pari a 1250, 1152 e 407 bp (dal 53° nucleotide del primo esone al 278° nucleotide del sesto esone, prendendo come riferimento la sequenza bovina disponibile in banca dati – EMBL acc. no. AY241932). Di questi, il primo trascritto è correttamente assemblato e codifica per una proteina di 359 aminoacidi, mentre gli altri due sono la risultante di splicing alternativi e rispetto al primo risultano deleti rispettivamente di 101 nucleotidi (dal 182° nucleotide del secondo esone alla fine dello stesso) e di 843 nucleotidi (dal 228° nucleotide del secondo esone al 217° nucleotide del sesto esone) . Ciò porterebbe all’eventuale traduzione di due isoforme proteiche del tutto diverse, costituite rispettivamente da 105aminoacidi (di cui gli ultimi 45 di nuova costituzione) e da 104 aminoacidi (di cui gli ultimi 19 frutto della traduzione di una parte del sesto esone normalmente solo trascritta). Il sequenziamento dei trascritti e delle sequenze genomiche (ottenute utilizzando il DNA estratto dai leucociti di due bufale di razza Mediterranea Italiana, allevate nella provincia di Salerno) ha permesso di determinare la struttura del gene per un totale di 13746 bp comprendenti 5083 bp di regioni esoniche, 8079 bp di regioni introniche e 584 bp di regione promotrice. Il gene SCD è risultato essere organizzato in 6 esoni di dimensioni variabili da 131 bp (esone 3) a 4059 bp (esone 6) e 5 introni di grandezza compresa tra 516 bp (introne 1) e circa 3870 bp (introne 2). Tutte le giunzioni di splice seguono la regola comune 5’GT/ 3’AG. La regione codificante ha inizio al 145° nucleotide del primo esone, mentre lo stop codon (TGA) si realizza tra i nucleotidi 198-200 del sesto esone. Il confronto delle sequenze ottenute e tra queste e quelle depositate in banca dati, ha evidenziato un totale di 16 SNP: 11 transizioni e 5 trasversioni con un rapporto transizioni/trasversioni (ti/ts) pari a 2,2. In particolare, a livello intronico sono stati evidenziati 7 SNP (cinque transizioni e due transversioni ), mentre a livello esonico sono stati osservati 8 cambiamenti nucleotidici: 2 al quinto esone e 6 al 6° esone. Riguardo ai primi due, evidenziati mediante il confronto con la sequenza disponibile in banca dati (EMBL acc. no. DQ646700), il più interessante è il polimorfismo realizzatosi al 231° nucleotide del 5° esone (GCGAlaGTGVal) in quanto nella specie bovina è stato associato a differenti contenuti di acidi grassi monoinsaturi (MUFA) nelle carcasse e nel latte. Dei sei SNP riscontrati a livello del sesto esone, il primo (transversione AAla→C) è l’unico che ricade nella regione codificante (al 107° nucleotide del sesto esone). I restanti 5 SNP (transizioni) ricadono nella regione 3’UT del 6° esone. E’ stata, infine, individuata una transversione A→C al nucleotide -461 della regione del promotore (prendendo come riferimento numerico +1 il primo nucleotide del primo esone). Tale mutazione risulta di particolare rilievo in quanto sembrerebbe determinare un’estensione di un preesistente sito consenso del fattore di regolazione dell’espressione genica Sp1 (15 bp vs 12, da -459/-448 a -464/-450). Al fine di evidenziare i portatori della transversione A→C in posizione -461 del promotore è stata messa a punto una metodica basata sulla PCR-RFLP in quanto la presenza della Citosina al posto dell’Adenina è responsabile della comparsa di un sito di restrizione dell’enzima TaqI (T!CGA) all’interno del tratto amplificato. La digestione con tale endonucleasi ha prodotto nei campioni analizzati 3 differenti pattern elettroforetici, di cui uno caratterizzato da un’unica banda (752 bp -omozigote A/A), il secondo contraddistinto da due frammenti di restrizione (620 bp e 132 bp - omozigote C/C) ed il terzo rappresentato da tre bande ( 752, 620 e 132 bp - eterozigote A/C) . L’indagine preliminare di popolazione, condotta su 117 bufale allevate nella provincia di Salerno, ha evidenziato che 84 soggetti risultano omozigoti per la presenza dell’Adenina, gli individui eterozigoti sono, invece, 27. Solo 3 soggetti sono, infine, risultati omozigoti per la presenza della Citosina