Untersuchungen zur Reparatur Methylmethansulfonat-induzierter DNA-Schäden

Die DNA-schädigende Wirkung von alkylierenden Agenzien wie Methylmethansulfonat (MMS) wurde in den letzten Jahren intensiv untersucht. Einige Studien ergaben dabei Hinweise darauf, dass sich die schädigende Wirkung dieser Substanzen hauptsächlich während der S-Phase des Zellzyklus manifestiert. Diese Theorie kann anhand der meisten klassisch durchgeführten Untersuchungen wie Überlebensexperimenten oder chromosomalen Studien aber nicht überprüft werden, da diese technischen Ansätze lediglich eine Beurteilung der Wirkung eines Agenz auf die gesamte, untersuchte Zellpopulation erlauben. Daher wurde in dieser Arbeit ein Zellzyklus-spezifischer Ansatz zur Analyse MMS-induzierter DNA-Schäden etabliert. Dies wurde durch eine Kombination der γH2AX-Immunfluoreszenzanalyse mit einer Markierung replizierender Zellen durch halogenierte Thymidin-Analoga möglich. Mit Hilfe dieser Zellzyklus-spezifischen γH2AX-Analyse konnte bestätigt werden, dass γH2AX-Foci nach einer MMS-Behandlung fast ausschließlich während der S-Phase induziert werden. Dies stellt einen deutlichen Hinweis dafür dar, dass es nach einer MMS-Behandlung zur Ausbildung Replikations-assoziierter DNA-Schäden kommt. MMS-induzierte Basenmethylierungen werden durch die Basen-Exzisionsreparatur (BER) behoben, einem Prozess, der die temporäre Ausbildung von Einzelstrangbrüchen (SSB) beinhaltet. Durch die Untersuchung XRCC1-defizienter Zellen, welche die während der BER erzeugten SSBs akkumulieren, konnte in der vorliegenden Arbeit der Prozess der Ausbildung MMS-induzierter γH2AX-Foci genauer charakterisiert werden. Diese XRCC1-defizienten Zellen zeigten nach einer MMS-Behandlung eine deutlich erhöhte Induktion an γH2AX-Foci. Konsistent mit einer beschriebenen Hypersensitivität dieser Zellen gegenüber alkylierenden Agenzien verdeutlicht dieses Ergebnis, dass während der BER erzeugte SSBs zur Ausbildung von γH2AX-Foci nach MMS beitragen. Hier kann ein Prozess eines replication fork run-off postuliert werden, wenn Replikationsgabeln auf die temporär erzeugten SSBs treffen. Dabei kommt es zur Ausbildung ein-endiger Doppelstrangbrüche (DSB), die als γH2AX-Foci detektierbar werden. Die direkt durch MMS induzierten Basenmethylierungen tragen dagegen kaum zur Ausbildung von γH2AX-Foci nach MMS bei. Sie können aber Replikationsgabeln transient blockieren und führen somit zusammen mit den ein-endigen DSBs zu einer verlangsamten Progression MMS-behandelter Zellen durch die S-Phase. Zahlreiche Überlebensstudien in den letzten Jahren haben eine starke Empfindlichkeit von Zellen mit einer Defizienz im DSB-Reparaturprozess der Homologen Rekombination (HR) gegenüber MMS und anderen Alkylanzien beschrieben. Daher wird diesem Reparaturweg eine entscheidende Funktion bei der Reparatur MMS-induzierter Schäden zugeschrieben. Anhand der in dieser Arbeit angewandten Zellzyklus-spezifischen γH2AX-Immunfluoreszenzanalyse konnte diese Annahme nicht nur bestätigt werden, die erstellten γH2AX-Reparaturkinetiken verdeutlichen sogar eine Determinierung der nach einer MMS-Behandlung erzeug-ten ein-endigen DSBs für den HR-Weg. Eine Reparatur dieser Schäden über den Prozess der Nichthomologen End¬verknüpfung (NHEJ) ist dagegen selbst unter der Bedingung einer HR-Defizienz nicht möglich. Der Prozess der HR ist aber nicht für die Reparatur Replikations-abhängiger DSBs, wie sie nach MMS auftreten, von Bedeutung. Frühere Studien dieser Arbeitsgruppe demonstrierten eine essentielle Rolle des HR-Wegs für die Reparatur Heterochromatin-assoziierter DSBs nach einer Bestrahlung in der G2-Phase. Durch einen Vergleich des Reparaturverhaltens unterschiedlicher reparaturdefizienter Zelllinien nach einer MMS-Behandlung und nach einer Bestrahlung in der G2-Phase konnten in dieser Arbeit Unterschiede in den genetischen Anforderungen dieser beiden distinkten HR-Vorgänge detektiert werden. So besitzen die Kinase ATM und die Nuklease Artemis beispielweise essentielle Funktionen im heterochromatischen HR-Weg in der G2-Phase, für die HR-abhängige Reparatur ein-endiger DSBs nach einer MMS-Behandlung sind beide Proteine aber nicht von Bedeutung. Anhand durchflusszytometrischer Analysen wurde in dieser Arbeit auch der Einfluss einer MMS-Behandlung auf das Zellzyklusverhalten untersucht. Dabei wurden eine MMS-bedingte Verlangsamung der S-Phase-Progression sowie ein lang anhaltender Zellzyklus-Arrest in der Spät-S/G2-Phase detektiert. Der eingeleitete G2/M-Checkpoint ist dabei sehr effektiv, denn in mitotischen Zellen konnten nach einer MMS-Behandlung keine zusätzlichen Schäden in Form von γH2AX-Foci detektiert werden. Durch die Analyse unter¬schied¬licher Zellzyklus¬stadien in der S- und G2-Phase wurden in dieser Arbeit zudem deutliche Hinweise dafür erhalten, dass Wildtyp-Zellen nach einer MMS-Behandlung für sehr lange Zeit in einem späten Stadium der S-Phase persistieren. Ein Übergang in die G2-Phase und anschließend in die Mitose scheint erst dann möglich zu werden, wenn der Großteil der MMS-induzierten, ein-endigen DSBs repariert wurde. Auf HR-defiziente Zellen ist dieses Verhalten aber nicht uneingeschränkt übertragbar, denn diese Zellen können mit einer erhöhten Zahl unreparierter DSBs in die G2-Phase progressieren. Ein Übergang in die Mitose wird aber auch in HR-defizienten Zellen unterbunden. Worauf dieses unterschiedliche Zellzyklusverhalten von HR-defizienten und Wildtyp-Zellen basiert, ist noch unklar und wird Gegenstand weiterer Unter¬suchungen sein