Das Repressorprotein GvpD aus Haloferax mediterranei

Die Regulation der Gasvesikelbildung in halophilen Archaea wird durch mindestens zwei Proteine gewährleistet: GvpE ist ein Transkriptionsaktivator, der einem basischen Leucinzipper-Protein ähnelt, und GvpD ist an der Repression der Gasvesikelbildung beteiligt. Das GvpD-Protein weist in seiner Aminosäuresequenz ein p-loop-Motiv und zwei basische Regionen auf, die für seine Funktionalität entscheidend sind. Eine Interaktion der beiden Proteine mcGvpE und mcGvpD aus Haloferax mediterranei war bereits bekannt sowie eine Bindung von ATP an mcGvpD. Auch führt die gleichzeitige Anwesenheit von mcGvpD und mcGvpE in Haloferax volcanii-Transformanten zu einer starken Reduktion der mcGvpE-Menge und könnte somit den negativen Regulationsmechanismus der Gasvesikelbildung darstellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Deletionsmutanten des mcGvpD-Proteins hergestellt, um den mcGvpE-Interaktionsbereich genauer zu lokalisieren. Durch Bindungsstudien mit Deletionsmutanten im p-loop-Motiv konnte eine Beteiligung dieser Region an der Interaktion mit mcGvpE ausgeschlossen werden. Analysen mit weiteren mcGvpD-Deletionsmutanten zeigten, dass weder die N-terminale Region noch die C-terminale Region an der Interaktion mit mcGvpE beteiligt sind, sondern eher ein zentraler Bereich des Proteins. Der reduzierende Effekt von mcGvpD auf die Menge des mcGvpE-Proteins (oder auf das cGvpE-Protein von Halobacterium salinarum) wurde ebenfalls in Hfx. volcanii-Transformanten näher untersucht, um die hierfür notwendigen mcGvpD-Bereiche zu definieren. DEex-Transformanten, die die mc-gvpDE-Leserahmen unter der Kontrolle des fdx-Promotors in pJAS35 exprimieren, enthalten kaum mcGvpE. Zur leichteren Analyse der Wirkung verschiedener mcGvpD-Mutanten auf die mcGvpE-Menge wurde zunächst ein weiterer Expressionsvektor durch Inserierung des fdx-Promotors in pWL102 hergestellt. Die mcDex+mcEex- und mcDex+cEex-Doppeltransformanten, die beide Gene von verschiedenen Vektoren aus exprimierten, zeigten ebenfalls die mcGvpD-vermittelte Reduktion der GvpE-Menge. Eine verminderte mcGvpD-Menge wie in DEex-Transformanten konnte in den mcDex+Eex-Transformanten allerdings nicht beobachtet werden. Anhand der verschiedenen mcGvpD-Mutanten wurde deutlich, dass das p-loop-Motiv und die basische Region 1 für die mcGvpD-induzierte Reduktion der GvpE-Menge wichtig sind. Der reduzierende Effekt von mcGvpD findet nicht auf der Transkriptebene, sondern auf der Proteinebene statt. Alle mcGvpD-Mutanten, die die GvpE-Menge nicht reduzieren können, haben auch die Fähigkeit zur Repression der Gasvesikelbildung verloren, so dass die repressorische Wirkung des mcGvpD-Proteins offensichtlich in der Induktion der Degradation des Transkriptionsaktivators GvpE besteht. Ähnlich wie für mcGvpD wurden auch verschiedene cGvpE-Mutanten mit Substitutionen von konservierten Aspartatresten in mcDex+cEMutex-Transformanten auf ihre Stabilität hin untersucht. Keine der analysierten cGvpE-Mutanten war in Gegenwart des mcGvpD-Proteins stabil, wodurch eine Rolle dieser Aspartatreste als mögliche Modifikationsstelle für eine Markierung zur Degradation ausgeschlossen werden konnte. Erste Untersuchungen zur Quartärstruktur des mcGvpDhis-Proteins durch Gelfiltration, native Polyacrylamidgelelektrophorese und Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation deuteten an, dass das GvpDhis-Protein nicht nur in seiner monomeren Form, sondern als eine heterogene Mischung von oligomeren Komplexen mit unterschiedlichen molaren Massen vorliegt. Zusätzlich wurden auch mcGvpEhis und cGvpEhis hinsichtlich ihrer Quartärstruktur analysiert. All diese Proteine wurden jeweils sowohl in E. coli als auch in Hfx. volcanii produziert. Die in E. coli produzierten Proteine wurden denaturierend in 8 M Harnstoff gereinigt und durch Dialyse in 2,5 M KCl rückgefaltet. Der Vergleich der erhaltenen Ergebnisse zeigte, dass die hier untersuchten halophilen Proteine aus E. coli durch Dialyse nicht vollständig in ihre native Konformation überführt werden können. Bei der Reinigung von Gvphis-Proteinen aus Hfx. volcanii wurde ein weiteres, ca. 60 kDa großes Hfx. volcanii-Protein als Verunreinigung erhalten, das auch allein aus Hfx. volcanii gereinigt und durch N-terminale Sequenzierung als PitA identifiziert wurde (Bab-Dinitz et al., 2006). Dieses Protein weist eine interne Ansammlung von Histidinen auf, was seine Bindung an eine Ni-NTA-Matrix erklärt