Apfelextrakte als Modulatoren der DNA-Methylierung und Induktoren der Nrf2-ARE assoziierten antioxidativen Abwehr

Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Beeinflussung der Promotormethylierung durch einen Bohnapfelextrakt (BAE) und dessen Hauptinhaltsstoff n-Chlorogensäure (CGA) auf das Tumorsuppressorgen p16INK4a in humanen Kolonkarzinomzellen (HT29) und im Rahmen einer Pilotstudie an Typ-II Diabetes Patienten. Sowohl für BAE als auch für CGA konnte vereinzelt eine Abnahme der DNA-Methylierung des p16INK4a Promotors nach 48 h und 96 h beobachtet werden, wobei sich keine Zeit- und Konzentrationsabhängigkeit darstellte. Darüber hinaus zeigte sich für keine der beiden Testsubstanzen eine Reaktivierung des Tumorsuppressors auf Transkriptions- und Proteinebene. Im Rahmen einer Pilotstudie an Typ-II Diabetikern konnte bei 2 von 15 Probanden eine Methylierung des p16INK4a Promotors in abgeschilferten Kolonozyten aus Humanfäzes bestimmt werden. Nach vierwöchigem Konsum von naturtrübem Apfelsaft zeigte sich eine Verringerung der Promotormethylierung von p16INK4a bei diesen Probanden. Im Fokus des zweiten Abschnitts dieser Dissertation stand die Frage inwiefern polyphenol-reiche Apfeltresterextrakte (AT) aus entpektinisiertem Trester den intrazellulären Redoxstatus von HT29-Zellen beeinflussen und wie ihre Wirkstärke im Vergleich zu analog hergestellten Extrakten aus Apfelsaft (AS) einzustufen ist. Die Untersuchungen ergaben, dass AT gegenüber AS eine signifikant höhere Bioaktivität hinsichtlich einer Verringerung intrazellulärer ROS und einer Erhöhung der Transkripte des Enzyms Glutamylcysteinligase (GCL) besitzt. Weiterführende Experimente mit AT ließen darüber hinaus eine Aktivierung des Nrf2-ARE Signalwegs und eine verstärkte Transkription ausgewählter Enzyme des Phase-II Metabolismus erkennen. Untersuchungen der Leitverbindungen von AT im Zuge einer aktivitätsgeleiteten Fraktio-nierung ergaben, dass Phloretin und Quercetin einen geringen Beitrag zur Gesamtaktivität des komplexen Extrakts leisten. Dennoch müssen weitere, bisher nicht identifizierte Inhaltsstoffe in AT vorhanden sein, da die Wirkstärke weder durch die Leitverbindungen, noch durch die bekannten Einzelverbindungen erklärt werden kann. Ferner konnte anhand eines verdauungsmimetischen Ansatzes gezeigt werden, dass mit steigender Fermentationsdauer der Extrakte tendenziell eine Abnahme der Bioaktivität stattfindet, sie jedoch nicht verloren geht, was insbesondere für aufbauende in vivo Untersuchungen von Bedeutung ist.In the focus of the first part of this work was the modulation of the promoter methylation of the tumor suppressor gene p16INK4a by an extract of Bohnapfel (BAE) as well as its main constituent n-chlorogenic acid (CGA) in both, human colon carcinoma cells (HT29) and during a pilot intervention trial with type-II diabetic patients. BAE as well as CGA partially displayed a decrease in DNA methylation of the p16INK4a promoter after 48 h and 96 h incubation, however not in a time- and concentration-dependent manner. In addition, none of the two test compounds showed a re-activation of the tumor suppressor on both, transcription and protein levels. In a pilot trial with type-II diabetics 2 of 15 subjects reflected a methylation of the p16INK4a promoter in exfoliated colonocytes of human feaces. After four weeks of intervention with cloudy apple juice a reduction of the p16INK4a promoter methylation was observed in these two subjects. The focus of the second section of this thesis was the question whether polyphenol-rich apple pomace extracts (AT), obtained from depectinized pomace, are able to affect the intracellular redox state of HT29 cells allowing the classification of their potency compared to similarly prepared extracts of apple juice (AS). The studies showed that AT possesses a significantly higher bioactivity than AS regarding the reduction of intracellular ROS as well as the increase of the transcription of the enzyme glutamylcysteinligase (GCL). Further investigations indicated an activation of the Nrf2-ARE pathway and a downstream induction of selected enzymes of the phase-II metabolism. In the course of the activity-guided fractionation phloretin and quercetin could be identified as constituents, probably contributing to the total activity of the native AT. Nonetheless, a presence of yet unidentified constituents, possessing a high bioactivity seems to be likely, since the effect of the native extract cannot be explained by the effects reflected by the so far known individual constituents. Furthermore, using a digestive mimetic system a decrease of bioactivity with an increase in fermentation time of extracts became apparent. Nevertheless, the bioactivity is not completely lost, which is of special importance with respect to ongoing in vivo studies