HPLC analysis of plasmid isoforms with chemoaffinity based media

Diese Diplomarbeit beschäftigt sich mit der Analyse von Plasmid DNA Isoformen (superspiralisiert, ccc; offen zirkular, oc; linear, lin) und Topoisomeren. Dazu mussten zunächst oc Standards zweier Plasmide (4.9 kbp und 15 kbp) hergestellt werden. Die Transformation der superspiralisierten (ccc) Isoform in die Offen-zirkulare (oc) kann durch Temperaturbehandlung (4.9 kbp pDNA) oder durch Behandlung mit einem Enzym (15 kbp pDNA) erzielt werden, wobei jeweils ein optimiertes Protokoll entwickelt wurde. Anschließend wurden Methodenvalidierungen beider Plasmide mit zwei unterschiedlichen Säulenmaterialien durchgeführt. Die Validierungsergebnisse der Propylcarbamoyl Chinin Säule (5 µm, 100 Å, 150 x 4 mm ID), welche innerhalb der Arbeitsgruppe entwickelt und hergestellt wurde, wurde mit den Ergebnissen der laut aktuellen Stand der Wissenschaft für die Plasmidanalyse verwendeten DNA-NPR Chromatographiesäule (2.5 µm, 750 x 4.6 mm ID) verglichen. Die neu entwickelte stationäre Phase besitzt einige Vorteile im Vergleich zum kommerziell erhältlichen Material wie z.B. eine bessere Wiederfindung der oc Isoform, Auftrennung des oc und ccc Plasmids, bessere Peakperformance und Präzision. Darüber hinaus konnte eine erfolgreiche Methodenvalidierung des 15 kbp Plasmids mit dem neu entwickelten Material nicht aber mit der DNA-NPR Säule durchgeführt werden. Durch die Verringerung der Partikelgröße von 5 µm auf 1.5 µm (NPS Silika) konnte eine weitere Optimierung des PCQ modifizierten Materials erreicht werden. Mit den modifizierten NPS Micra Partikel konnte eine erfolgreiche Validierung der superspiralisierten und der linearen Isoform (4.9 kbp) durchgeführt werden. Der Einfluss der Fermentationsdauer zweier verschiedener Realproben auf die relative Topoisomerenverteilung wurde mittels eines zweidimensionalen HPLC Systems untersucht. In der ersten Dimension befand sich eine Größenausschluss-Chromatographiesäule (5 µm, 1000 Å, 150 x 7.8 mm ID), welche zur Abtrennung der Verunreinigungen von der Probe diente. Anschließend wurde der Analyt (pDNA) in die O-9-Allylcarbamoyl-10,11-Dihydrochinin modifizierte stationäre Phase transferiert. Diese Säule ermöglichte eine Auftrennung der Topoisomere. Es konnte gezeigt werden, dass die größte Änderung der Linking Nr. beider Proben innerhalb der ersten Stunden des Fermentationsprozess erfolgt. Summa summarum konnten neue Methoden für die pDNA Analyse entwickelt werden, welche auch für die weitere Forschung und Qualitätskontrolle auf diesem Gebiet von großer Bedeutung sein werden.This diploma thesis is dealing with the analysis of plasmid DNA isoforms (covalently closed circular, ccc; open circular, oc; linear, lin) and topoisomers. For this purpose suitable oc standard of two different plasmids (4.9 kbp and 15 kbp) had to be prepared initially. For preparation, optimized protocols (heat treatment for the 4.9 kbp plasmid or enzyme treatment for the 15 kbp plasmid) were developed for transforming supercoiled form into the open circular one. Subsequently, comparison of method validation for both plasmid samples of a novel support material, namely propylcarbamoyl quinine modified silica (5 µm, 100 Å, 150 x 4 mm ID), with the state-of-the-art method employing the DNA-NPR column (2.5 µm, 750 x 4.6 mm ID). The novel stationary phase offers several benefits compared to the commercial available DNA-NPR material, like better recovery for the oc form, separation of oc and ccc form, better peak performances and precisions. Moreover, the method validation for the 15 kbp plasmid was only successful using the new developed material but not with the DNA-NPR stationary phase. Further improvement of the PCQ modified material could be achieved when using 1.5 µm NPS silica particles as support. The NPS chromatographic material enabled successful validation except for the oc standard Supplementary, two different in-process control samples were analyzed using an online 2D HPLC system to study the influence of fermentation duration on relative topoisomer abundances. In the first dimension a SRT-SEC column (5 µm, 1000 Å, 150 x 4 mm ID) was employed for purification of the sample from impurities. Subsequently, the analyte of the transferred sample fraction was injected online into the O-9-allylcarbamoyl-10,11-dihydroquinine modified stationary phase which provides selectivity for topoisomers. The change of linking number in the first few hours during fermentation process could be demonstrated. Overall, new methods for pDNA analysis have been developed in the course of this diploma work which are supposed to be of great value in future plasmid research and quality control