Probenvorbereitung mit Sol-Gel - Immunaffinitätssäulen zur Bestimmung der Mykotoxine Deoxynivalenol und Zearalenon in Lebens- und Futtermitteln

Aufgrund der toxischen Wirkung der Mykotoxine Deoxynivalenol (DON) und Zearalenon (ZON) wurden in vielen Ländern Grenzwerte für ihr Vorkommen in Lebens– und Futtermitteln gesetzt. Bei der Bestimmung der DON- und ZON Konzentrationen werden zur Probenvorbereitung häufig kommerziell erhältliche Immunaffinitätssäulchen eingesetzt, in denen die Antikörper kovalent an einem festen Trägermaterial gebunden sind. Diese Säulchen haben jedoch den Nachteil, dass sie teuer sind und nicht wiederverwendet werden können. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Probenvorbereitungsmethoden, basierend auf dem Einsatz von Sol-Gel Immunaffinitätssäulen, zur Isolierung von DON, zur Isolierung von ZON und zur gleichzeitigen Isolierung von DON und ZON entwickelt. Dazu wurden entweder monoklonale DON– Antikörper, monoklonale ZON- Antikörper oder gleichzeitig DON- und ZON-Antikörper mittels der Sol–Gel Methode immobilisiert. Die Bestimmung von DON erfolgte mittels HPLC-UV Detektion, die Bestimmung von ZON mittels HPLC und Fluoreszenzdetektion. Die Selektivität der im Rahmen der Dissertation hergestellten Sol-Gel Säulchen war vergleichbar mit der von kommerziellen DON- bzw. ZON-Immunaffinitätssäulchen. Im Unterschied zu kommerziellen Immunaffinitätssäulchen konnten die Sol-Gel Säulchen jedoch wiederverwendet werden. Außerdem zeichneten sich die mit der Sol-Gel Methode hergestellten Säulchen durch eine hohe Lagerstabilität aus. Die Zugabe eines Bakteriostatikums ist nicht notwendig, da Mikroorganismen nicht zu den in den Poren des Sol-Gel Glases eingeschlossenen Antikörpern diffundieren können. Die Schwierigkeit bei der Entwicklung der Methode zur gleichzeitigen Isolierung von DON und ZON lag darin, ein Aufgabemedium zu finden, welches die Retention beider Mykotoxine ermöglichte, sowie ein Elutionsmittel, mit dem beide Antigen-Antikörper Komplexe dissoziiert wurden. In der mit Standardlösungen optimierten Methode wurden DON und ZON mit ACN-Wasser (60:40, v/v) co-extrahiert, danach die ACN-Konzentration durch Verdünnen auf 2,5 % reduziert und der verdünnte Extrakt auf die DON/ZON-Immunaffinitätssäule aufgegeben. Nach dem Waschen der Säulen konntenDON und ZON mit 4 ml ACN-Wasser (50:50, v/v) co-eluiert werden. Zur Anwendbarkeit auf Realproben war jedoch eine weitere Optimierung der Operationsbedingungen erforderlich.Due to the toxicity of deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZON) many countries have established regulations for the occurence of the two mycotoxins in food and feed. Commercial immunoaffinity columns are frequently used for sample clean-up in the determination of DON and ZON. However, these columns are single-use columns and suffer from high costs. In the present doctoral thesis, new sample clean-up methods, based on the use of sol-gel immunoaffinity columns, were developed for the isolation of DON, the isolation of ZON and the co-isolation of DON and ZON. Immunoaffinity columns were prepared by entrapping monoclonal DON antibodies, monoclonal ZON antibodies or co-entrapping DON and ZON antibodies. Determination of DON and ZON was carried out with HPLC – UV detection and HPLC – fluorescence detection, respectively. Selectivity of the sol-gel solumns was comparable with that of commercial DON or ZON immunoaffinity columns. However, in contrast to commercial columns, sol-gel columns were found to be re-usable. In addition, columns prepared by the sol-gel method showed a higher storage stability. The columns can be stored without adding a bacteriostatic agent since microorganisms are prevented from diffusion to the antibodies entrapped in the pores of the sol-gel glass. The main task in developing the method for co-isolating DON and ZON consisted in finding a loading medium allowing retention of both mycotoxins as well as a common elution medium for the dissociation of both antigen–antibody complexes formed. This was achieved by co-extracting DON and ZON with ACN–water (60:40, v/v), reducing the ACN concentration to 2.5% before loading an aliquot of the diluted sample extract onto the DON/ZON column. After washing the column DON and ZON were co-eluted with ACN–water (50:50, v/v). Additional optimization steps were, however, necessary before the DON/ZON column could be applied for sample clean-up