Assessment of therapeutic drug efficacy in the epithelial to mesenchymal transition of human liver cancer

Das hepatozelluläre Karzinom ist die sechst häufigste Krebserkrankung weltweit, dessen Inzidenz nach wie vor steigend ist. Die epitheliale zur mesenchymalen Transition (EMT), ein Prozess bei dem epitheliale Zellen ihre typische Organisation verlieren und dadurch in das umliegende Gewebe invadieren können, wurde als eine Hauptursache der fortschreitenden Leberkrebserkrankung und deren Metastasierung identifiziert. Ziel dieser experimentellen Studie war, ein humanes zelluläres Modell der EMT zu entwickeln, um einerseits molekulare Mechanismen der EMT zu identifizieren und andererseits die Effizienz antitumoraler Medikamente in diesem Prozess zu untersuchen. Dafür wurden zwei Leber-Zelllinien, welche einen epithelialen beziehungsweise einen mesenchymalen Phänotyp aufweisen, aus dem Tumor eines HCC Patienten isoliert. Die Immunfluoreszenzanalyse bestätigte die epithelialen und mesenchymalen Charakteristika dieser HCC Zelllinien. Weiters konnten wir zeigen, dass die mesenchymalen HCC Zellen, im Vergleich zu den epithelialen, eine höhere Migration und Invasion in vitro aufweisen. Die chromosomale Analyse mittels vergleichender genomischen Hybridisierung und eine ‘Short Tandem Repeat‘ Analyse bestätigten, dass beide Zelltypen ursprünglich aus einer Zelle entstanden sind. Dies zeigt damit eindeutig, dass sich die mesenchymalen Zellen durch eine EMT in vivo aus den epithelialen Zellen entwickelt haben. Durch die Expressionsanalyse des gesamten Transkriptoms konnte der Verlust von epithelialen und der Erwerb von mesenchymalen Markern nachgewiesen werden, wodurch eine EMT bestätigt wurde. Eine methylierungsspezifische Polymerase- Kettenreaktion (PCR) ergab weiters, dass das Protein ‘Secreted Protein, Acidic, Rich in Cystein‘ (SPARC), das in den mesenchymalen HCC Zellen stark überexprimiert ist, durch Demethylierung seines Promotors epigenetisch reguliert wird. Ebenso konnten wir zeigen, dass mesenchymale HCC Zellen im Vergleich zu den epithelialen HCC Zellen eine höhere Resistenz gegen zielgerichte Therapien wie Sorafenib und Erlotinib aufweisen, wohingegen epitheliale HCC Zellen stärker resistent gegen zytostatische Medikamente sind. Die Kombination von Doxorubicin und Sorafenib verursacht eine erhöhte Empfindlichkeit von beiden Zelllinien, was dazu führt, dass sich die maximalen mittleren inhibitorischen Konzentrationen (IC50) einander angleichen. Diese Kombination ist folglich eine effiziente Behandlung um beide, eptiheliale als auch mesenchymale Hepatomzellen erfolgreich zu eliminieren. Zusammenfassend konnten wir ein einzigartiges EMT Modell des humanen HCCs entwickeln, das in präklinischen Studien eingesetzt werden kann, um (i) die cytostatische Effizienz einer Substanz in vitro zu testen, (ii) ein Profil des Wirkstoffs mit dessen Auswirkung auf zelluläre Mechanismen zu erstellen und (iii) Synergismen mit weiteren Antikrebsmitteln zu identifizieren.Hepatocellular carcinoma (HCC) is the sixth most common cancer worldwide and the incidence is still increasing. The epithelial to mesenchymal transition (EMT) of malignant hepatocytes in HCC is considered as a major cause of liver cancer progression and metastasis. In this study we aimed to establish a human cellular model of HCC to investigate the molecular mechanisms of EMT and to examine the efficacy of anti-cancer agents in this process.Two liver cell lines were established from one HCC patient showing either an epithelial or mesenchymal phenotype. Immunofluorescence analysis confirmed the distinct epithelial and mesenchymal characteristics of HCC cells. Most remarkably, mesenchymal HCC cells showed enhanced migration and invasion in vitro. Comparative genomic hybridization and short tandem repeat analysis indicated a unique cellular origin of both cell types, suggesting that mesenchymal cells derived from epithelial hepatocytes via EMT in vivo. Loss of epithelial as well as gain of mesenchymal markers analyzed by whole genome expression profiling verified EMT. Interestingly, methylation-specific PCR analysis revealed epigenetic upregulation of secreted protein, acidic, rich in cystein (SPARC) in mesenchymal cells via promoter demethylation. Upon drug exposure, mesenchymal HCC cells showed a higher resistance to the targeted therapeutic agents sorafenib and erlotinib as compared to epithelial HCC cells, which were slightly more resistant to cytostatic drugs. Combination of doxorubicin and sorafenib caused an increased susceptibility of both cell lines to cytostatic effects resulting in an equalization of IC50 values, thus showing an effective treatment to target both, epithelial and mesenchymal cells. In conclusion, we established a unique EMT model of human HCC for pre-clinical studies which allows studying drug efficacy during HCC progression including the assessment of synergistic anti-cancer drug profiles