Regulation of T cell activation by ct-CD45

CD45 war eines der ersten signaling Moleküle die auf Leukozyten identifi-ziert worden sind und wird als Leukozyt Markermolekül verwendet. Es ist der Prototyp von Transmembranrezeptor ähnlichen Protein Tyrosin Phos-phatasen (PTPs) und es werden verschiedene Isoformen davon auf allen kernhaltigen hematopoetischen Zellen exprimiert. CD45 spielt eine essen-zielle rolle im Immunsystem indem es verschiedene Substrate dephospho-ryliert. Vor kurzem wurde, von unserer Gruppe, eine alternative Funktion für die intrazelluläre Domäne dieses Proteins (ct-CD45) gefunden. Es wurde gezeigt, dass wenn humane Monozyten und Granulozyten mit Pilz-stimuli aktiviert werden CD45 gespalten und ct-CD45 freigesetzt wird. Die-ses ct-CD45 agiert als zytokinähnlicher Faktor, der die T Zell Proliferation hemmt wenn diese mit dendritischen Zellen oder CD3 Antikörper aktiviert werden. Der zytoplasmatische Teil von CD45 kann dabei als interzellulärer Regulator zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem wirken. In dieser Studie wurde die direkte Wirkung von ct-CD45 auf die Aktivierung und die Funktion von T Zellen in einem APC freien System weiter untersucht. Wir haben entdeckt, dass ct-CD45 die Proliferation von peripheren T Zellen inhibiert wenn diese über CD3 oder CD3/CD63 akti-viert werden aber nicht wenn sie mit CD3/CD28 stimuliert werden. Im Ge-gensatz dazu hatte ct-CD45 keinen Einfluss auf die Proliferation von Na-belschnurblut T Zellen, die auf die gleiche Weise aktiviert worden sind. Überraschender Weise wurde dennoch die Produktion von IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 und IFN gamma stark reduziert, auch in den T Zellen bei denen die Proliferation nicht gehemmt worden ist. Die einzige Ausnahme war IL-4, welches eine erhöhte Produktion in Nebelschnur Blut T Zellen in der Anwesenheit von ct-CD45 zeigte. Genauso wie die Zytokine wurde auch die Expression von neu synthetisierten Aktivierungsmarkern wie CD25, CD97 und MHCII und auch die Oberflächenexpression von CD69, das zum Teil schon in intrazellulären Pools gespeichert wird und dann von dort aus an die Zelloberfläche gebracht wird, herunter reguliert. Darüber hinaus haben wir entdeckt, dass diese mit ct-CD45 behandelten T Zellen bei Restimulierung ohne ct-CD45 keine Proliferation zeigen und dass die-ser Effekt nur zum Teil durch Zugabe von IL-2 rückgängig gemacht wer-den kann. Außerdem haben wir versucht einen möglichen Rezeptorkandidaten für ct-CD45 auf aktivierten T Zellen zu finden. Es wurde gezeigt, dass dieses Protein spezifisch an aktivierte T Zellen bindet und dass diese Bindung mit mAb blockiert werden kann. Bindungsassays mit einer cDNA Bibliothek für aktivierte T Zellen haben eine Bindung zwischen ct-CD45 und einem Pro-tein (PRAT4A), das mit dem Toll-like Rezeptor 4 assoziiert ist, gezeigt. PRAT4A wurde vor kurzem entdeckt und als ER-residentes Chaperon be-schrieben, das unentbehrlich für das Trafficking der meisten TLRs ist. Obwohl dieses Protein als ER-resident beschrieben worden ist ist es uns gelungen es auch auf der Zelloberfläche von aktivierten T Zellen nachzu-weisen. In dieser Diplomarbeit haben wir gezeigt, dass PRAT4A ein potentieller Rezeptorkandidat für ct-CD45 ist und dass die Bindung dieses cytoplas-matischen Teiles von CD45 an aktivierte T Zellen zu einem Anergie ähnli-chen Stadium führt, das nur zum Teil durch Zugabe von IL-2 umgekehrt werden kann.CD45 was one of the first signaling molecules identified on leukocytes and is used as a leukocyte marker molecule. It is the prototypic member of transmembrane receptors like protein tyrosine phosphatases (PTPs) and various forms of it are expressed on all nucleated hematopoetic cells. CD45 plays an essential role in immune functions by dephosphorylating different substrates. Recently an alternative function for the intracellular domain of CD45 (ct-CD45) was discovered by our group. It was shown that CD45 is cleaved and ct-CD45 is released during activation of human monocytes and granulocytes by fungal stimuli. Furthermore ct-CD45 was found to ct-CD45 act as a cytokine like factor which inhibits T cell prolifera-tion induced by dendritic cells or CD3 antibodies. The cytoplasmatic tail of CD45 can thereby act as an intercellular regulator between the innate and the adaptive immune system. In this study the direct impact of ct-CD45 on the activation and function of T cells was further investigated in an antigen presenting cell free system. We found that ct-CD45 inhibited CD3 and CD3/CD63 but not CD3/CD28 induced proliferation in peripheral T cells and that it did not inhibit the proliferation of cord blood T cells which were stimulated the same way. Surprisingly the production of IL-2, IL-4, IL-10, IL-13, IL-17 and IFN gamma was strongly reduced even in those T cells whose proliferation was not inhibited. The only exception was IL-4 which showed an increased production in cord blood T cells upon stimulation in the presence of ct-CD45. In line with the downregulation of cytokine pro-duction the expression of de novo synthesized activation markers on the cell surface of T-cells like CD25, CD97 and MHCII and the surface ex-pression of CD69, which originate in part from preformed intracellular pools, was down regulated. Furthermore we found out that these ct-CD45 treated T cells show no proliferation upon restimulation without ct-CD45 and that this effect can be only partly reversed by addition of exogenous IL-2. In addition to that we were trying to find a possible receptor candidate for ct-CD45 on activated T cells. It was shown that this protein binds specifi-cally to activated T cells and that this binding can be blocked by mAb. Binding assays with a cDNA library for activated T cells gave evidence for interaction of ct-CD45 and a protein associated with Toll-like receptor 4 (PRAT4A). PRAT4A was recently discovered as an ER-resident chaperon which is indispensable for the trafficking of most TLRs. Even though this protein is described as ER resident binding assays showed that PRAT4A is also expressed on the cell surface of activated T cells. In this study we showed that PRAT4A is a possible receptor candidate for ct-CD45 and that the binding of this cytoplasmatic part of CD45 to acti-vated T cells lead to an anergy like hyporesponsive state that can only be partly reversed by the addition of exogenous IL-2