Construction of mutants of Natrialba magadii and φCh1

Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung der ersten Deletionsmutante eines halo(alkalo)philen Phagen und des daraus hervorgehenden Stammes Nab. magadii L11Δ79. Der offene Leserahmen (ORF) 79 des ins Genom von Nab. magadii integrierten Phagen φCh1 wurde mit Hilfe einer Novobiocin Resistenzkassette unterbrochen. Ein „suicide“ Plasmid, welches den disruptierten ORF79 trägt, wurde in Nab. magadii L11 transformiert, und Rekombination des mutanten Genes mit dem ORF79 Wildtyp Gen konnte nachgewiesen werden. Anschließend wurde die Kultur lysiert um mutante Phagenpartikel zu erhalten. Diese Viren wurden im darauffolgenden Schritt zur Infektion des Stammes Nab. magadii L13 verwendet. Nab. magadii L13 enthält keine virale φCh1 DNA und kann daher infiziert werden. Durch die Infektion des Stammes mit Virenpartikeln, welche die disruptierte Version des ORF79 besitzen, entstand der Stamm Nab. magadii L11Δ79. Die Funktion von ORF79 des Phagen φCh1 ist noch unbekannt, jedoch könnte die in dieser Arbeit entwickelte Mutante bei deren Entschlüsselung eine wichtige Rolle spielen. Deletionsmutanten von weiteren φCh1 ORFs, ORF11 und ORF93, wurden ebenfalls erreicht. Die Entwicklung der entsprechenden Nab. magadii Stämme, welche diese mutanten Viruskopien beinhalten, ist jedoch noch in Arbeit. Der zweite Teil dieser Diplomarbeit beschäftigt sich mit dem Versuch zur Entwicklung eines Nab. magadii Stammes, welcher deletierte Versionen der Flagellin Gene enthält. Die Flagellin Gene flaB1 – flaB4 von Nab. magadii sind in einem Operon angeordnet. Durch die Transformation eines Plasmids, welches verkürzte Versionen der Gene flaB2 und flaB3 enthält, und eine darauffolgende Rekombination mit den Wildtyp Flagellin Genen, konnten die mutanten Kopien in den Stamm eingebracht werden. Da Nab. magadii bis zu 25 Chromosomenkopien enthält, ist die Entwicklung einer homozygoten Flagellin-Mutante noch in Arbeit. Der dritte Teil dieser Arbeit beschreibt die Klonierung eins neuen Shuttle- Vektors für Nab. magadii und E. coli. Das Plasmid beinhaltet Replikationsloci für beide Organismen sowie zwei Resistenzgene. Während Mevinolin für die Selektion in Nab. magadii verwendet werden kann, beinhaltet der Vektor weiters ein Ampicillin Resistenzgen für E. coli. Durch eine vorhandene „multipe cloning site“ können auf einfache Weise mehrere Gensequenzen in das Plasmid kloniert werden.This work describes the first ever deletion mutant of a halo(alkali)philic phage and the resulting archaeal strain, Nab. magadii L11Δ79, carrying the mutant virus. The ORF79 of the haloalkaliphilic phage φCh1 was disrupted with a novobiocin resistance cassette. Nab. magadii L11, the wild type strain of the archaeon carrying the phage φCh1 integrated its genome, was transformed with a suicide plasmid harbouring the deleted gene version of ORF79. Recombination of the gene with its wild type counterpart in the viral DNA was achieved. Phage particles carrying the deleted version of ORF79 were harvested and used for infection of Nab. magadii L13, a strain formerly cured of φCh1. This resulted in Nab. magadii L11Δ79, a strain that is infected with phage copies deficient in ORF79 exclusively. The function of ORF79 has yet to be determined, the generated archaeal strain might be a great support to decipher this in the future. Furthermore, deletion mutants of two other ORFs of the phage φCh1, ORF11 and ORF93, were aspired. Deletion mutants of the phage genes were achieved and the work to generate archaeal strains carrying these deletions will continue. The second part of the work at hand describes the attempt to achieve a strain of Nab. magadii L13 deficient in two flagellum genes. The genes flaB1 – flaB4 are arranged in an operon. A suicide plasmid carrying deleted gene versions of the genes flaB2 and flaB3 was constructed and transformed into Nab. magadii. Recombination of the deleted gene versions with their wild type counterparts was achieved. Since Nab. magadii is harbouring up to 25 genome copies, the still ongoing work is concerned with the generation of a homozygote mutant strain. In the third part of this thesis, the cloning of a new shuttle vector for Nab. magadii and E. coli is described. The plasmid is carrying origins of replication for both organisms and a mevinolin and ampicillin resistance gene for selection in Nab. magadii and E. coli, respectively. A multiple cloning site allows easy cloning work and the integration of more than one gene into the plasmid. The fourth part of this work describes the attempt to characterise the nuclease domain of the φCh1 methyltransferase M.NmaφCh1I. Expression of the gene was not successful in E. coli, since the halophilic nuclease protein seems to be active in the Bacteria, being a lethal factor for the cells