Molecular characterisation of an artificial kinetochore in budding yeast

Während der Zellteilung ist es entscheidend, dass die genomische Information der sich teilenden Zelle zu gleichen Teilen an die Tochterzellen weitergegeben wird. Dafür ist ein spezieller Apparat nötig, der eine feste Verbindung zwischen den Chromosomen und den Mikrotubuli des Spindelapparates bereitstellt. Die komplizierte Aufgabe, eine kraftübertragende Verbindung zu dynamischen Mikrotubuli aufzubauen, wird vom Kinetochor, einem komplizierten Multiproteinkomplex, erfüllt. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae, der Modelorganismus der in der folgenden Arbeit verwendet wurde, bindet jedes Kinetochor an einen einzelnen Mikrotubulus. Da das Kinetochor eine sehr komplizierte Struktur darstellt, ist eine genaue Analyse der einzelnen Komplexe oder gar individueller Proteine eine gewaltige Aufgabe. Die Etablierung eines Systems, das die Komplexität des Kinetochors auf minimale Notwendigkeiten reduziert, wäre hilfreich um die funktionellen Eigenschaften einzelner Proteine zu analysieren. Dies wurde erreicht, indem einzelne Kinetochorproteine durch Fusion mit einer DNA-Bindungsdomäne direkt an die DNA rekrutiert wurden. Daraufhin konnten jene an eine Abfolge von entsprechenden Erkennungssequenzen auf kleinen, zirkulären Minichromosomen binden. Untereinheiten des Dam1 Komplexes, vor allem das Protein Ask1p, zeigten in dieser Versuchsanordnung eine signifikante mitotische Stabilisierung dieser Minichromosomen. Die hier gezeigten Daten deuten darauf hin, dass mit diesem System der gesamte Dam1 Komplex an die DNA rekrutiert wird. In nativen Kinetochoren spielt dieser Proteinkomplex eine wesentliche Rolle im Aufbau der Verbindungen zu den Mikrotubuli und in der Weiterleitung von Kräften während der Segregation von Chromosomen. Die funktionelle Charakterisierung des auf diese Weise konstruierten artifiziellen Kinetochors in temperatur-sensitiven Hefemutanten ergab, dass seine Funktion in der Segregation der Minichromosomen unabhängig von einigen essentiellen Kinetochorproteinen ist. Die Eigenschaft, eine kraftübertragende Verbindung zwischen dynamischen Mikrotubuli und dem Kinetochor aufbauen zu können, ist also ein intrinsisches Merkmal des Dam1 Komplexes. Es bleibt noch zu klären, wie das artifizielle Kinetochor reguliert wird, damit es korrekt an Mikrotubuli der Spindel bindet und an beide Tochterzellen weitergegeben werden kann. Die direkte Visualisierung lässt vermuten, dass Minichromosomen, die unter der Kontrolle des artifiziellen Kinetochors stehen, weit weniger Kohäsion aufbauen können, als jene mit einer Zentromersequenz und einem nativen Kinetochor. Es wird interessant sein zu sehen, wie das artifizielle Kinetochor, trotz minimaler Kohäsion zwischen den Schwesterchromatiden, eine korrekte Segregation der Minichromosomen während der Mitose vermitteln kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das artifizielle Kinetochor ein nützliches Werkzeug zur Untersuchung der Eigenschaften eines einzelnen Kinetochor-Komplexes darstellt.During the process of cell division it is crucial for a cell to segregate its genomic material equally. Therefore a machinery is required, which establishes a firm connection between chromosomes and microtubules of the mitotic spindle. The challenging task is to assemble load-bearing attachments to the highly dynamic microtubule plus-ends. This is achieved by the kinetochore, a huge structure composed of several protein subcomplexes. In Saccharomyces cerevisiae, the model organism used for the following study, a single microtubule is connected to each kinetochore. Since the kinetochore displays a very difficult structure, detailed analysis of individual complexes or even proteins is a very daunting task. In order to identify minimal requirements for chromosome segregation in vivo, it would be helpful to work with a system that allows to investigate functional properties of individual proteins. This was achieved by artificially tethering individual kinetochore proteins directly to DNA by fusing them to a DNA binding domain. This allowed them to bind to an array of the according recognition site on a small circular minichromosome. Subunits of the Dam1 complex, especially Ask1p, achieved significant mitotic stabilisation of minichromosomes in this assay. Our data suggested, that the entire Dam1 complex is tethered to the minichromosomes in this system. In native kinetochores the complex is known to play a role in microtubule attachments and force transduction during chromosome segregation. Functional characterisation of the artificial kinetochore in temperature-sensitive yeast mutants revealed that it functions independently of several essential kinetochore proteins. Thus, the property to form load-bearing attachments is an intrinsic characteristic of the Dam1 complex. How processes like biorientation are achieved for the artificial kinetochore remains to be established. Judged by live cell imaging experiments, it seems that there is much less cohesion established on minichromosomes which are under the control of the artificial kinetochore, than on their wildtype counterparts, carrying a native centromeric sequence. It will be interesting to investigate if bi-orientation can also be established with a minimal amount of cohesion. In summary, the artificial kinetochore provides a useful tool for investigating the properties of an individual kinetochore complex