Optimierung der Folsäureextraktion mittels enzymatischer Methoden und Fällungsmethoden aus Humanplasma zur Messung des Folsäuremetaboloms

Das essentielle Vitamin Folsäure ist in Form ihrer zahlreichen Metabolite für verschiedene biochemische Körperfunktionen im Bereich der Übertragung von 1-Kohlenstoffresten bei der DNA- und Aminosäurensynthese unersetzlich. Eine Unterversorgung mit schweren Spätfolgen ist auch in Industrieländern nicht so selten. Bekannt ist das Vitamin als das kritische Vitamin in der Schwangerschaft, da hier eine höhere Aufnahme benötigt wird, die allerdings durch eine normale Ernährung sehr schwer zu erreichen ist. Deswegen sind Supplementierungen noch vor der Schwangerschaft notwendig, um bestimmte Embryonalschädigungen wie Spina bifida zu vermeiden. Wegen der Gefahr verschiedener Mangelsymptome wie obstruktiver Gefäßerkrankungen, megaloblastärer Anämie, Entstehung bestimmter Krebsarten und verschiedener Schwangerschaftskomplikationen, deren Entwicklung noch dazu von genetischen Faktoren beeinflusst wird, besteht dringendes Bedürfnis nach einer schnellen und einfachen Labor-Routine-Methode zur Detektion der Folatversorgung und somit zur Risikoerkennung und Begrenzung in der Bevölkerung. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht so eine einfache Routinemethode zu entwickeln und diese mit schon bestehenden und oft verwendeten Fällungsmethoden zu vergleichen. Die Methodenentwicklung beschränkte sich auf das Humanplasma als Probensubstanz, dessen Plasmaproteine durch die Enzyme Pankreatin oder Protease, abgebaut wurden, mit dem Ziel der Freisetzung von proteingebundenen Folaten. Zur Optimierung dieser Methode wurde eine bekannte Menge an 5-Methyl-Tetrahydrofolsäure (5-MTHF) hinzugefügt, um das Ausmaß des Verlustes während der enzymatischen Inkubation des Plasmas bei 37°C zu beschreiben. Die spezifische 5-MTHF-Messung erfolgte durch HPLC/ESI-MS. Eine vorherige Aufreinigung der 5-MTHF erfolgte über die Festphasenextraktion (SPE). Zum Vergleich wurden Fällungen mit Trichloressigsäure (TCA), Acetonitril (ACN), Ethanol (70%) und meta-Phosphorsäure (50%) durchgeführt. Bis auf die meta-Phosphorsäure-Fällungsmethode zeigten sich alle der durchgeführten Versuche, mit eingeschlossen der zu optimierenden enzymatischen Methode als ungeeignet für eine zuverlässige Folatbestimmung im Plasma.The vitamin folic acid, in form of its different metabolites, is essential for various biochemical functions based on transfer of 1-carbon-groups in DNA- and amino acid synthesis. Even in industrial countries severe malabsorption symptoms are common. Folic acid is mostly known as the critical vitamin in pregnancy, during which a raised intake is recommended. Such an intake is very often not possible to cover with food alone. Therefore a supplementation is necessary even before pregnancy to avoid some typical embryonal damages like spina bifida. In case of malabsorption, many dangerous symptoms like occlusive vascular disease, megaloblastic anemia, different types of cancer and birth defects were characterized. The occurance of these symptoms is even more common, if a certain genetic background exists. Therefore a specific and quick laboratory analysis for detection of folic acid body concentrations is necessary to minimize the risk of late damages. In this thesis it was tried to find such a routine method and to compare it with well known and often accomplished precipitation methods. The method development has used human plasma as test substrate for the enzymes pancreatin and protease, which were compared in the efficacy of digesting plasma protein and further release of protein-bound folates. For method optimization a known amount of 5-methyl-tetrahydro folic acid (5-MTHF) is added to the samples, to describe the amount of folate degradation during the enzymatic incubation (37°C). The specific 5-MTHF detection was done with HPLC/ESI-MS. Before measurment a specific 5-MTHF clean-up step with solid phase extraction (SPE) was performed. Precipitation methods with TCA (10%), ACN, ethanol (70%) and meta-phosphoric acid (50%) were compared with the enzymatic method to be optimized. Any trials except the precipitation with meta-phosphoric acid (50%), proved to be unreliable as methods for detection of folates