Genetic analysis of Rap1 GTPase function in vertebrate axis extension and somitogenesis

Die Bildung von Somiten, den segmentären Vorläufern der Skelettmuskulatur und der Wirbelsäule, ist ein Prozess während der Embryogenese in der Gruppe der Wirbeltiere. Somiten bilden sich der Reihe nach von anterior zu posterior an beiden Seiten der Chorda dorsalis, wobei der Embryo gleichzeitig nach posterior wächst. Mesodermale Zellen wandern dabei kontinuierlich in die Schwanzknospe und führen dadurch zum Längenwachstum des Embryos. Ein Strukturierungsmechanismus, die so genannte ‚somite clock’ erzeugt oszillierende Genexpression im pre-somitischen Mesoderm. Diese Oszillationen erzeugen ein Segmentmuster, wodurch die Somitogenese reguliert wird. Stabilisierung der Oszillationen im anterioren PSM führt zur Segmentpolarität und folglich zur morphologischen Segmentierung. Somiten bilden sich, wenn die äußersten Zellen einer zukünftigen Somite eine mesenchymal-to-epithelial transition (MET) durchlaufen, während die angrenzenden Zellen eine extrazelluläre Matrix aus Fibronektin assemblieren. Die Fibronektin Matrix ist wichtig zur Stabilisierung der Somitenabgrenzung und für die Vervollständigung der Somitenmorphogenese. Fibronektin ist der Ligand des Transmembranproteins Integrinα5. Während der Somitogenese scheint Integrinα5 durch ‚inside-out’ Signalisierung segmentäre Fibronektin Matrix Assemblierung sicherzustellen. Studien deuten darauf hin, dass Eph/Ephrin Signalisierung einen Einfluss auf die Entstehung von Somitenabgrenzung hat, und weisen weiters auf einen Zusammenhang mit Integrinα5 hin. Die Fachliteratur schlägt vor, dass Eph/Ephrin Signalisierung vielleicht die kleine GTPase Rap1 reguliert. Es wurde gezeigt, dass Rap1 an der Integrin-vermittelten Zelladhäsion durch ‚inside-out’ Signalisierung während der T-Zellen Aktivierung beteiligt ist. Die Anfangshypothese war daher, dass Eph/Ephrin Signalisierung die kleine GTPase Rap1 aktiviert, was zur Integrinα5 Aktivierung und Clusterbildung führt. Integrinα5 wiederum assembliert allgegenwärtige sekretierte Fibronektin Dimere in eine unlösbare extrazelluläre Matrix, wodurch die Somitenabgrenzung stabilisiert wird. Um diese Hypothese zu untersuchen und die Funktion der zwei Isoformen rap1a, rap1b und eines rapGEFs zu charakterisieren, wurden Morpholino vermittelter Knockdown, in situ Hybridisierung und Immunohistochemie durchgeführt. Übereinstimmend mit der Hypothese, dass Rap1 Integrinα5 während der Somitogenese reguliert, wurde ein genetisches Zusammenspiel zwischen Rap1 Signalisierung und Integrinα5 aufgewiesen, wobei aber die Verknüpfung des Eph/Ephrin Signalisierung, des Rap1 Signalisierung und der Integrinα5 Aktivierung noch zu klären bleibt.Somitogenesis is the process in which the segmental precursors of the skeletal muscle and vertebral column are generated during vertebrate embryogenesis. Somites form in an anterior to posterior sequence along both sides of the notochord concomitant with the posterior elongation of the embryo. Continuous migration of mesodermal progenitor cells in the tail bud drives axial growth. A patterning mechanism called the somite clock creates oscillating gene expression in the presomitic mesoderm. These oscillations create a segmental pattern that governs somitogenesis. Stabilisation of the oscillations in the anterior PSM establishes segment polarity, leading to morphological segmentation. Somites form as somite border cells undergo mesenchymal-to-epithelial transition. Simultaneously, the boundary cells assemble an extracellular matrix composed of Fibronectin, which stabilizes the border and is necessary for the completion of somite morphogenesis. Fibronectin is the ligand of the transmembrane protein Integrinα5. During somitogenesis, Integrinα5 appears to be activated via ‘inside-out’ signalling to ensure segmental Fibronectin matrix assembly. Studies indicate that Eph/Ephrin signalling has an impact on somite border formation and furthermore suggest a correlation to Integrinα5. Literature suggests that Eph/Ephrin signalling may regulate the small GTPase Rap1, which was shown to be involved in Integrin-mediated cell-adhesion via ‘inside-out’ signalling during T-cell activation. Here, the starting hypothesis was that Eph/Ephrin signalling activates the small GTPase Rap1, which leads to Integrinα5 activation and clustering. In turn, Integrin assembles ubiquitously secreted Fibronectin dimers into an insoluble extracellular matrix, which stabilizes the somite border. To investigate the hypothesis, morpholino mediated knockdown experiments, in situ hybridisation and immunochemistry to characterize the function of the two isoforms rap1a and rap1b and of one rapGEF were performed. Consistent with the hypothesis that Rap1 regulates Integrinα5 during somitogenesis, a genetic interaction between Rap1 signalling and Integrinα5 was found, whereas the link between Eph/Ephrin signalling, Rap1 signalling and Integrinα5 activation still has to be established