Molecular mechanisms of transcriptional repression by the EWS-FLI1 oncogene in Ewing’s Sarcoma

Ewing-Sarkome sind die am zweithäufigsten auftretenden Knochen- und Weichteil-tumore bei Kindern. Sie sind klein-rund-blauzellige Tumore, die hohe Spiegel des Zelloberflächen-Glykoproteins CD99 exprimieren und sich durch die t(11;22) (q24;q12) Translokation auszeichnen. Diese führt zum EWS-FLI1 Fusionsgen, welches in 85% aller Tumore der Ewing-Sarkom Familie gefunden werden kann. Mittels der Affymetrix Gen Chip Technologie analysierte unser Labor die Gen-expression von sechs Ewing-Sarkom-Zelllinien und fand 73 überexprimierte Gene und 52 Gene mit verringerter Expression. Diese Daten legen nahe, dass EWS-FLI1 nicht nur als transkriptionaler Aktivator, sondern auch als Repressor funktioniert. Unter den reprimierten Genen fanden wir den Notch-Liganden JAG1, das Notch-Zielgen Hey1 und den Zellzyklus-Inhibitor p21. Die direkte Reprimierung von p21 durch die Bindung von EWS-FLI1 an putative ETS Motive wurde bereits publiziert. p21 arretiert den Zellzyklus in der G1-Phase nach der Aktivierung von p53. In den 10kb der p21-Promoter-Region sind mehrere p53 und Ets Bindungsmotive zu finden, aber nur an zwei Stellen beide innerhalb weniger Nukleotide. Wir beschreiben hier erstmalig eine Genreporteranalyse von 14 Genreporterkonstrukten, welche in überlappenden Fragmenten 10kb der p21-Promoter-Region abdecken. EWS-FLI1 Knock-down resultierte in erhöhter Expression von p21 in den beiden p53 und Ets enthaltenden Konstrukten, in einer p53wt Ewing-Sarkom-Zelllinie, nicht aber in einer Zelllinie mit mutiertem p53. Induktion von p53 und Knock-down von EWS-FLI1 erhöhte die Expression von p21 noch stärker, während ein Knock-down von p53 p21 verringerte. Diese Daten legen nahe, dass p53 in die Genregulation von p21 durch EWS-FLI1 involviert ist. EWS-FLI1 Knock-down resultierte in einer erhöhten Expression von JAG1 in Reporter Gen Assays mit zwei JAG1-Konstrukten, die 1.7kb bzw. 573bp der JAG1-Promoter-Region enthalten. Unsere Daten lassen vermuten, dass sich das regulatorische Element für die Repression von JAG1 in den 573bp befindet. EWS-FLI1 Knock-down führte zu erhöhter Expression von Hey1 in Reporter Gen Assays mit zwei Hey1-Konstrukten, die 3.9kb bzw. 1.7kb der Hey1-Promoter-Region beinhalten. Unsere Daten deuten darauf hin, dass für die Repression von Hey1 durch EWS-FLI1 die 3.9kb Sequenz notwendig ist. Wir konnten in dieser Arbeit zeigen, dass EWS-FLI1 als transkriptionaler Repressor, nicht nur p21, sondern auch die Notch-Signalübertragungsweg Komponenten JAG1 und Hey1 reprimiert.Ewing’s sarcoma is the second most common bone and soft tissue cancer in children with an occurrence of 1-3 cases in 1 million people. Ewing’s sarcoma are small round blue cell tumors that express high levels of the cell surface glycoprotein CD99 and carry the t(11;22) (q24;q12) translocation. This generates the EWS-FLI1 fusion gene which can be found in 85% of all Ewing’s sarcoma family tumors. Using Affymetrix gene chip technology, our lab had analyzed the gene expression in six Ewing’s sarcoma cell lines and found 73 overexpressed genes and 52 genes repressed by EWS-FLI1. These data indicate that EWS-FLI1 may act not only as transcriptional activator, but also as a transcriptional repressor. Among these repressed genes we found, the Notch ligand JAG1, the Notch target Hey1 and the cell cycle inhibitor p21. It has already been published, that p21 is directly repressed by EWS-FLI1 by binding to a putative Ets motif within the p21 promoter. p21 is a cyclin-dependent kinase inhibitor, and as a direct target of p53, it arrests the cell cycle in G1 after activation of p53. Several p53 and Ets binding motifs are distributed over 10kb of the p21 5’ flanking sequence, but remarkably there are two sites where both, p53 and Ets motifs were found in a cluster. We describe here for the first time a gene reporter analysis of 14 reporter gene constructs which contain overlapping parts covering 10kb of the p21 promoter region. shRNA mediated knock down of EWS-FLI1 resulted in the upregulation of p21 in those two constructs which contain both Ets and p53 binding sites in a p53wt Ewing’s sarcoma cell line, but not in a p53mut cell line. Induction of p53 via Etoposide treatment and knock down of EWS-FLI1 resulted in even higher induction of those two constructs in the p53wt cell line, whereas knock down of p53 reduced them. These data indicate strongly that p53 is involved in the gene expression regulation of p21 by EWS-FLI1. Reporter gene assays using two JAG1 constructs encoding for 1.7kb and 573bp of the JAG1 promoter region resulted in an induction for both constructs upon knock down of EWS-FLI1 in several cell lines. Our data indicate that the regulatory element responsible for the repression of JAG1 by EWS-FLI1 is within the 573bp. Knock down of EWS-FLI1 resulted in an induction of Hey1 in reporter gene assays using two constructs encoding for 3.9kb and 1.7kb of the Hey1 promoter region. Our data suggest that the 3.9kb sequence is necessary for full repression by EWS-FLI1. We could demonstrate here that EWS-FLI1 acts as a transcriptional repressor, not only for p21, but as well for the Notch pathway components JAG1 and Hey1