Functional genomics and proteomics of virus-induced innate immunity pathways

Das angeborene Immunsystem stellt die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Pathogene dar. Zellen des angeborenen Immunsystems wie z. B. Makrophagen exprimieren Mustererkennungsrezeptoren (pattern recognition receptors), die konservierte Strukturen vieler Mikroorganismen, sogenannte Pathogen-assoziierte molekulare Muster (pathogen-associated molecular patterns), erkennen. Viren werden vorwiegend durch die Anwesenheit ihrer Genome detektiert und lösen eine Signaltransduktionskaskade aus, die zur Sekretion von Typ I Interferonen (IFNα und IFNβ) führt. Typ I Interferone sind essentiell für die Ausbildung antiviraler Immunität, da sie die Replikation des Virus hemmen und die spezifische Immunabwehr stimulieren. Allerdings sind die Signal-transduktionswege, die zur Interferoninduktion führen, nicht vollständig geklärt, und während die ersten cytosolischen Nukleinsäuresensoren entdeckt werden, häufen sich die Indizien für die Existenz weiterer, noch unbekannter Rezeptoren. Das Ziel dieser Diplomarbeit war, neue Nukleinsäurerezeptoren, die maßgeblich zur angeborenen antiviralen Immunantwort beitragen, zu identifizieren. Im Mittelpunkt des Projekts stand die Hypothese, dass Nukleinsäurerezeptoren an Nukleinsäuren binden und von Nukleinsäuren transkriptionell reguliert werden. Folglich wurde eine Kombination aus Proteomik und Genomik als experimenteller Ansatz gewählt. Zwei Datensätze wurden generiert: Der Proteomikdatensatz enthält Proteine, die an Nukleinsäuren binden. Zu diesem Zweck wurden Pulldown- Experimente mit immobilisierten Nukleinsäuren durchgeführt um Nukleinsäure- bindende Proteine zu isolieren, die anschließend mittels Massenspektrometrie identifiziert wurden. Gene, deren Expression durch Nukleinsäure-stimulation transkriptionell reguliert werden, wurden mithilfe von Microarrays erfasst und repräsentieren den Genomikdatensatz. Basierend auf der eingangs erwähnten Hypothese, wurden die Proteine, die in beiden Datensätzen vorhanden waren, in eine Kandidatenliste aufgenommen. Zu den 24 Kandidaten zählen fünf Proteine, deren Funktion innerhalb der Nukleinsäuresignaltransduktion bereits bekannt ist, wie z. B. die Rezeptoren für doppel-strängige RNA (dsRNA) RIG-I und MDA-5. Die Tatsache, dass diese fünf Proteine Teil der Kandidatenliste sind, validiert den experimentellen Ansatz. Nachdem die Kandidatenliste erstellt worden war, wurden die Microarray- Ergebnisse mittels real-time PCR bestätigt. Weiters wurden die Kandidaten auf ihre funktionelle Relevanz für die Entstehung einer Nukleinsäure-stimulierten antiviralen Immunantwort untersucht. Zu diesem Zweck wurde die Auswirkung des Silencings der einzelnen Kandidaten durch RNA- Interferenz auf IFNβ− Induktion aufgrund Stimulation mit Nukleinsäuren mittels real-time PCR bestimmt. Die fünf Kontrollkandidaten zeigten die erwarteten Effekte, und zwölf der restlichen 19 Kandidaten hatten einen positiven Einfluss auf die IFNβ Induktion, wenn mit dem synthetischen dsRNA- Analogon polyI:C stimuliert wurde. Im Rahmen dieser Diplomarbeit wurde somit die Basis für weiterführende Untersuchungen zur Identifikation von Nukleinsäurerezeptoren geschaffen. Parallel zu der auf RNA- Interferenz basierenden Evaluation der Kandidaten wurde das DNA- modifizierende Enzym Kandidat 4 genauer untersucht. Kandidat 4 ist ein IFNβ- induzierbares, perinukleäres Protein. Mutationen, die eine Inaktivierung von Kandidat 4 nach sich ziehen, bewirken eine schwere Erkrankung mit entzündlicher Komponente. Welche Rolle Kandidat 4 bei DNA- stimulierter IFNβ- Induktion spielt, konnte aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse nicht geklärt werden. Weitere Versuche sind notwendig um die Funktion von Kandidat 4 zu verstehen.The innate immune system is the first line of defense against invading pathogens. Innate immune cells such as macrophages express pattern recognition receptors (PRRs) that detect conserved structures shared by many microbes, so-called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). Viruses are typically sensed by the presence of their genomes. Various PRRs are implicated in virus detection and trigger a signaling cascade that leads to the secretion of type I interferon (IFNα und IFNβ). Type I interferons are essential for antiviral immunity, as they limit virus replication and stimulate the adaptive immune system. However, the knowledge on the signaling pathways leading to interferon induction is still incomplete, and while the first cytosolic nucleic acid sensors are being identified, evidence for the existence of more, yet unknown receptors accumulates. Therefore, the aim of my diploma thesis was to identify novel nucleic acid sensors implicated in antiviral innate immunity. The central hypothesis was that nucleic acid receptors bind to nucleic acids and are transcriptionally regulated by nucleic acid stimulation. To this end we chose a combined proteomics and genomics approach. Two datasets were generated: The proteomics dataset consists of nucleic acid binding proteins that were identified by pull-down experiments with immobilized nucleic acids and subsequent mass spectrometry analysis. The genomics dataset includes genes that are regulated by nucleic acids as determined by microarray analysis. Based on the before mentioned hypothesis, proteins that belonged to both datasets were selected to compile a list of 24 candidate proteins. Among these 24 candidates are five proteins with an established role in nucleic acid signaling e. g. the receptors for double-stranded RNA (dsRNA), RIG-I and MDA-5, whose presence in the candidate list validates the approach. Once the candidate list had been generated, the microarray data was confirmed for selected candidate by real-time PCR. In order to assess the functional relevance of each candidate for antiviral innate immunity, the effect of candidate silencing on nucleic acid-stimulated IFNβ induction was measured by real-time PCR. The five control candidates showed the expected effects and 12 out of the 19 remaining candidates positively regulate IFNβ induction by polyI:C, the synthetic analogue of dsRNA. Thus this thesis provided the basis for further research leading to the identification of additional nucleic acid receptors. In parallel to the RNAi-based evaluation of candidates, the DNA-modifying enzyme candidate 4, was investigated in more detail. Candidate 4 is a IFNβ-inducible, perinuclear protein. When inactivated by mutation, candidate 4 has been reported to cause a severe disease with an inflammatory component. Contradictory results were generated regarding its role in DNA-mediated IFNβ induction. Therfore, further studies are needed to elucidate its mechanism of action