Calcium dependent protein kinases as regulators of developmental processes in Arabidopsis thaliana

Während ihres Lebenszyklus müssen sich Pflanzen konstant an sich verändernde äußere Bedingungen, wie Verfügbarkeit von Licht und Nährstoffen oder auch an abiotische und biotische Stresse anpasen. Der ubiquitäre second messenger Ca2+ spielt eine zentrale Rolle in der Transduktion externer Signale in molekulare Antworten. Die Vielzahl der räumlich-zeitlichen Ca2+ Wellenmuster ermöglicht die Spezifität der einzelnen Signale und wird durch zwei große Familien von Signaltransduktionsmolekülen, den Calcineurin B-like Protein interagierenden Proteinkinasen (CBL/CIPKs) und den Calcium-abhängigen Proteinkinasen (CDPKs) in die endogenen Netzwerke der metabolischen und Entwicklungsprozesse integriert. Diese Arbeit konzentrierte sich auf die Calcium-abhängige Proteinkinase CPK3 aus Arabidopsis thaliana. Im ersten Teil wurden CPK3 Knockout- und Überexpressor-Linien auf Transkriptebene charakterisiert und phänotypische Differenzen unter bestimmten Wachstumsbedingungen analysiert. Von früheren Arbeiten war bekannt, dass CPK3 als positiver Regulator in Salzstressantwort wirkt. Hier wurde die Rolle von CPK3 in der transkriptionellen Regulation bekannter Salzstressantwortgene mittels RT-PCR analysiert. Der CPK3 Gehalt in den untersuchten Pflanzen hatte keinen Einfluss auf das transkriptionelle Induktionsmuster unter Salzstress. Daher wurde vermutet, dass CPK3 Salzstressantwort hauptsächlich auf post-transkriptioneller Ebene reguliert, ähnlich wie es bereits für Mitglieder der CBL/CIPK Familie gezeigt worden war, die den Plasmamembran Na+/H+ antiporter Salt overly sensitive (SOS) 1 oder den high-affinity K+ Transporter AKT1 durch Ca2+-abhängige Phosphorylierung aktivieren. Um den Einfluss von CPK3 auf die K+-Homöostase durch Regulation von K+-Kanälen zu evaluieren, wurden die CPK3-Linien auf Medium mit verschiedenen K+-Konzentrationen angebaut. Ein weiteres Experiment wurde begonnen, um mögliche Kompensation der CPK3- Funktion in CPK3 Knockout Pflanzen durch CDPK-Redundanz zu untersuchen. Spezifische RTPCR Primer wurden für alle übrigen Arabidopsis CDPKs designed um Transkript-Levels in Wildtyp und Knockout in verschiedenen Geweben und Entwicklungsstadien zu vergleichen, sowie um in silenced CPK3 Überexpressor Pflanzen mitausgeschaltete homologe Gene zu identifizieren. Im zweiten Teil wurde die Interaktion von CPK3 mit Basic Leucine Zipper Transkriptionsfaktoren (bZIPs) weiter untersucht. C-Gruppen bZIPs, bZIP9 und 63 waren bereits in einem früheren Yeast-2-Hybrid Screen als Interaktionspartner von CPK3, sowie als in vitro Phosphorylierungsargets identifiziert worden. Transiente Expression von bZIP9 und 63 als YFP-Fusionen zeigte deren ausschließliche Lokalisierung im Zellkern. Mit Hilfe von in vitro Kinase-Assays and MS Analyse konnten multiple CPK3-Phosphorylierungsstellen in beiden bZIPs nachgewiesen werden. Der Vergleich von Ergebnissen über Interaktion von CPK3 mit bZIP9 und 63 aus Yeast-2-Hybrid und Kinase-Assay zeigte, dass Yeast-2-Hybrid eine sub-optimale Methode für die Untersuchung der Interaktionen einer Proteinkinase ist. Die Analyse von bZIP Knockout- Linien zeigte einen möglicher Früh-Blüh-Phänotyp in bzip63.During their life cycle, plants constantly have to adapt their metabolism and development to varying external conditions, such as availability of light and nutrients as well as abiotic and biotic stresses. The ubiquitous second messenger Ca2+ plays a central role in transduction of external signals into molecular responses. The multitude of spatio-temporal Ca2+ wave patterns creates specificity for each signal and is integrated into the endogenous metabolic and developmental networks by two major families of signal transduction molecules, the Calcineurin B-like protein interacting protein kinases (CBL/CIPKs) and the Calcium dependent protein kinases (CDPKs). This work focused on the calcium dependent protein kinase CPK3 of Arabidopsis thaliana. In the first part CPK3 mutant and overexpressor lines were characterized on transcript-level and analyzed on phenotypic differences under specific growth conditions. From previous works, CPK3 was known to act as positive regulator in salt stress response. Here, the role of CPK3 in transcriptional regulation of known salt stress response genes was analyzed via RT-PCR. CPK3 levels in the analyzed plants had no influence on the transcriptional induction pattern under salt stress. Therefore it was presumed that CPK3 mainly regulates salt stress response on the post-transcriptional level, similar to as it had been shown for members of the CBL/CIPK family, which activate the plasmamembrane Na+/H+ antiporter Salt overly sensitive (SOS) 1 or the high-affinity K+ transporter AKT1 by Ca2+-dependent phosphorylation. To evaluate the influence of CPK3 on K+ homeostasis via regulation of K+ channels, the CPK3 lines were grown on medium with different K+ concentrations. An additional experiment was started to investigate possible compensation of CPK3 function in CPK3 knock out plants through CDPK redundancy. Specific RT-PCR primers were designed for all remaining Arabidopsis CDPKs to compare transcript levels in wild type and knock out in different tissues and developmental stages, as well as in silenced CPK3 over-expressor plants to identify co-knocked down homologous genes. In the second part, interaction with target proteins identified in a previous yeast-2-hybrid screen, the basic leucine zipper transcription factors (bZIPs) was further investigated. The C-group bZIPs, bZIP9 and 63, had already been identified as in vitro phosphorylation targets of CPK3. Transient expression of bZIP9 and 63 YFP-fusions revealed their exclusive localization to the nucleus. Using in vitro kinase assays and MS analysis, multiple CPK3 phosphorylation sites in both bZIPs were identified. Comparing results on interaction of CPK3 with bZIP9 and 63 in yeast-2-hybrid and kinase assay, it became evident that yeast-2-hybrid is a sub-optimal method for the analysis of protein kinase interaction. Analysis of bZIP knock out lines uncovered a possible early-flowering phenotype in bzip63