GSK3-β – ein Modulator proinflammatorischer Prozesse in primären humanen Colon Lamina Propria Fibroblasten und in Kolonepithelzellen

Sowohl die Ätiologie als auch die Pathogenese chronisch entzündlicher Darmerkrankungen sind bisher nicht hinreichend geklärt. Für die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten dieser chronischen Krankheiten ist jedoch die genaue Kenntnis des chronischen Entzündungszustandes wichtig. Eine fehlregulierte TLR-Signaltransduktion scheint entscheidend für die Aufrechterhaltung der chronischen Entzündungsreaktion zu sein. Welche Signalmoleküle des TLR-Signalwegs unter chronisch entzündeten Bedingungen verändert aktiviert sind, ist bisher jedoch nicht bekannt. GSK3-β wurde kürzlich als ein möglicher Regulator der TLR-abhängigen Signaltransduktion beschrieben. Die Aktivität dieses Enzyms fördert pro-inflammatorische Immunantworten in Blutmonozyten, während anti-inflammatorische Mechanismen blockiert werden. Die Vorarbeiten der Arbeitsgruppe zeigen, dass die Hemmung von GSK3-β mittels LiCl auch überschießende TLR-vermittelte Immunantworten intestinaler Immunzellen auf bakterielle Bestandteile blockiert. Die Rolle von GSK3-β für Entzündungsprozesse in mesenchymalen Zellen ist bisher jedoch noch unklar. Im Hauptteil dieser Arbeit wurde daher der Effekt der GSK3-β-Blockierung auf die Funktion von Colon Lamina Propria Fibroblasten (CLPF) aus Gewebe von Kontroll- und CED-Patienten untersucht. In zusätzlichen Versuchen wurde der basale Protein- und Phosphorylierungsstatus der GSK3-β in Gesamtgewebe und in bestimmten Zellpopulationen des menschlichen Darms von Kontroll-, MC- und CU-Patienten bestimmt, der Effekt einer GSK3-β-Inhibition hinsichtlich entzündlicher Prozesse in Epithelzellen der HT-29-Epithelzellinie getestet und der GSK3-β-Status sowie die Sekretion bestimmter Zytokine von CLPF nach Kontakt mit Liganden verschiedener TLR-Rezeptoren ermittelt. Um diese Fragestellung zu klären wurden CLPF aus chirurgischem Material oder aus Biopsien von Kontroll- und CED-Patienten isoliert. Nach Stimulation der CLPF mit TNF oder LPS in An- und Abwesenheit des GSK3-β-Inhibitors LiCl erfolgte die quantitative Bestimmung der IL-6- und IL-8-Konzentrationen in den Überständen mittels ELISA. Die GSK3-β-Phosphorylierung und der Status weiterer zytoplasmatischer Proteine wurde jeweils in Zelllysaten mittels Western Blot bestimmt. Des weiteren wurden aus stimulierten CLPF Zellkernextrakte gewonnen und mittels DNA-Bindungsassays die Aktivität der Transkriptionsfaktoren NF-κB und CREB bestimmt. Dieselben Methoden wurden für die Versuche mit HT-29-Zellen und für die CLPF-Stimulation mit verschiedenen TLR-Liganden angewendet. Der Proteinstatus und die Phosphorylierung von GSK3-β in primärem Kolon-Gewebe sowie in bestimmten primären Zellpopulationen des menschlichen Darms von Kontroll- und CED-Patienten ergab keine einheitliche Tendenz. In HT-29-Zellen führte eine Blockierung der GSK3-β mittels LiCl sowohl basal als auch bei Kostimulation mit TNF oder LPS zu einer signifikant erhöhten IL-8-Sekretion. Nach TNF- und LiCl-Kostimulation waren auch die proinflammatorischen Parameter NF-κB, pERK und phospho-p38 erhöht. Die GSK3-β scheint daher in Epithelzellen der HT-29-Zelllinie in grundlegend anderer Weise Einfluss auf die Entzündungsreaktion zu nehmen als in den meisten bisher untersuchten Zellpopulationen. Der Phosphorylierungsgrad der GSK3-β in primären humanen CLPF wurde durch verschiedenen TLR-Liganden nicht beeinflusst. Trotzdem zeigten sich deutliche Unterschiede hinsichtlich des Ausmaßes der Zytokinsekretion von IL-6 und IL-8. Die in vitro LiCl-Behandlung von primären humanen CLPF führte zu einer deutlich erhöhten GSK3-β-Phosphorylierung, was auf eine effektive Hemmung des Enzyms hindeutet. Die GSK3-β-Inhibition bewirkte eine Reduktion der basalen und induzierten IL-6- und IL-8-Sekretion von Kontroll- und CED-Zellen, jedoch in unterschiedlicher Effektivität. Den deutlich stärkeren reduktiven Effekt hatte die GSK3-β-Hemmung auf die Sekretion von IL-6. CLPF von MC-Patienten zeigten nach GSK3-β-Inhibition im Vergleich zu Kontroll- und CU-CLPF für alle Stimulationsbedingungen eine sehr viel ausgeprägtere IL-6- und IL-8-Reduktion. Eine Hemmung der GSK3-β scheint also besonders bei MC-CLPF einen protektiven Effekt vor einer übermäßigen Immunreaktion bei Kontakt mit inflammatorischen Stimuli zu bieten. Sowohl die basale als auch die LPS-induzierte NF-κB-Aktivität war in Gegenwart von LiCl vermindert, wodurch der Rückgang der pro-inflammatorischen Zytokinproduktion erklärt werden kann. Die Hemmung von GSK3-β zeigt somit anti-inflammatorische Effekte auf CLPF aus Kontroll und CED-Gewebe. GSK3-β scheint daher nicht nur ein zentraler Regulator TLR-vermittelter Immunantworten in intestinalen Immunzellen zu sein, sondern auch bestimmte entzündliche Prozesse in mesenchymalen Zellen wie CLPF zu modulieren