Expressions- und Immunogenitätsstudien einer neuen Generation sequenzmodifizierter HIV-1 Subtyp B gagpolnef DNA Vakzinekandidaten

In der vorliegenden Arbeit wurden modifizierte HIV-1 Vakzinekandidaten hinsichtlich ihrer Expression und Immunogenität untersucht. Der RNA- und kodonoptimierte Leserahmen der Impfstoffvarianten basierte auf dem HIV-Subtyp B und kodierte für synthetische GagPolNef- bzw. PolNef-Polyproteine, die sich bezüglich des Vorhandenseins des natürlichen HI-viralen ribosomalen Leserastersprunges, von Nef sowie der Aktivität der viralen Protease unterschieden. Aus Sicherheitsgründen wurde die Integrase deletiert und die Reverse Transkriptase inaktiviert, darüber hinaus wurde das Myristylierungssignal in Gag entfernt. Neu wurde an die 3`-terminalen Enden der Varianten die Gensequenz von env-V3, die ein gut charakterisiertes H-2d-restringiertes T-Zell-Epitop kodiert, als Reporter angefügt, um im Rahmen von in vivo-Studien zusätzlich zu Gag-spezifischen T-Zellen auch Aussagen zu potentiellen PolNef-spezifischen T-Zell-Antworten zu ermöglichen. Die getesteten GagPolNef-Impfstoffkandidaten waren in der Lage, sowohl humorale als auch CD8+ T-Zell-Immunantworten gegen Gag bzw. den env-V3-Reporter (V3) zu induzieren. Die Synthese des 160 kD GagPolNef-Durchleseproteins im Ausgangskonstrukt resultierte in detektierbaren, aber niedrigen Gag (A9I)- und V3-spezifischen T-Zell-Antworten. Diese T-Zell-Antworten sowie die Expression der Vakzinekandidaten konnten weder durch Deletion des nef-Gens noch durch Aktivierung der viralen Protease verbessert werden, wohingegen das Wiedereinfügen des natürlichen HI-viralen ribosomalen Leserastersprunges die Expressionsraten von Gag steigern und stärkere Gag- und V3-spezifische T-Zell-Antworten induzieren konnte. Demgegenüber induzierten Konstrukte, die die funktionsfähige virale Protease enthielten, schwächere Epitop-spezifische Immunantworten. Die effizienteste Immunantwort gegen Gag und V3 wurde durch das GagPolNef-Polygen-Konstrukt erreicht, das neben einem funktionellen Leserastersprunges eine inaktive Protease und kein Nef enthielt. Des Weiteren wurden unterschiedliche PolNef-Varianten entworfen, um das Vektorinsert zu verkleinern und so die Aufnahme der Plasmide und nachgelagert die Expression der Impfstoffkandidaten zu verbessern. Auch hier wurde entsprechend die V3-Gensequenz 3´-terminal an den Leserahmen angefügt, mit Hilfe derer die Auslese stattfand. Korrelierend zu den obigen Ergebnissen wirkte sich auch bei den PolNef-Varianten die Inaktivierung der Protease positiv auf die Immunogenität der Vakzinekandidaten aus. Die Deletion der nef-Sequenz führte zudem zu gesteigerten zellulären Immunantworten. Darüber hinaus konnte bei den Varianten ohne gag- und nef-Gensequenz ein Anstieg der Pol-spezifischen T-Zell-Antworten verzeichnet werden