Generierung und molekulare Charakterisierung rekombinanter humaner Zytomegalieviren mit spezifischen Mutationen im Immediate Early 1-Gen

Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Subfamilie der β-Herpesviren und zeichnet sich unter anderem durch eine strikte Speziesspezifität und einen langsamen Replikationszyklus aus. Trotz allgemein hoher Prävalenz des Virus beschränken sich HCMV-bedingte Gesundheitsschäden hauptsächlich auf immunsupprimierte Patienten und intrauterin infizierte Feten nach Primärinfektion von Schwangeren. Die vorhandenen Virustatika können wegen ihres ungünstigen Nebenwirkungsprofils und des Auftretens resistenter Virusstämme nicht immer erfolgreich eingesetzt werden, weshalb die Entwicklung neuer Konzepte zur antiviralen Prävention und Therapie eine wichtige Aufgabe darstellt. Hierfür sind das molekularbiologische Studium des Infektionszyklus und der Einfluss kritischer viraler Komponenten von elementarer Bedeutung. Die viralen major immediate-early (MIE)-Proteine beeinflussen als Schlüsselregulatoren in der initialen Phase der Infektion in entscheidender Weise den weiteren Verlauf der HCMV-Replikation und Pathogenese. Das 72 kDa IE1-Protein (IE1) wird dabei als erstes virales Genprodukt nach Infektion synthetisiert. Es akkumuliert in großen Mengen im Kern der Wirtszelle und moduliert dort unter anderem die Chromatin-Struktur, die zelluläre und virale Genexpression sowie die Integrität subnukleärer Multiproteinkomplexe (PML [promyelocytic leukemia]-Körper). Bisher beschriebene HCMV-Mutanten deuten auf eine wichtige, aber nicht essenzielle Rolle des IE1-Proteins für die Virusvermehrung in Zellkultur hin. Um die Konsequenzen des spezifischen Funktionsverlustes der viralen IE1-Genprodukte eindeutig zu klären, wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Typen von Mutationen sowohl in einem etablierten Laborstamm (Towne, TN), als auch in einem klinischen Primärisolat (fusion inducing factor x, FIX) in das IE1-spezifische Exon 4 der HCMV MIE-Transkriptionseinheit eingeführt. Einige davon führten über eine Exon 4-Substitution zum kompletten Verlust der Expression von IE1. Darüber hinaus ist eine genaue Kenntnis regulatorischer Proteindomänen innerhalb des IE1-Proteins für die systematische Manipulation einzelner Funktionen unabdingbar. Deshalb wurden zusätzlich, durch minimal invasiven Austausch von einem bis maximal drei Nukleotiden an relevanten Stellen des IE1-spezifischen Exon 4, diverse vermutete Protein-Motive gezielt ausgeschaltet. Zu diesem Zweck entstanden im ersten Schritt Transferplasmide mit der jeweiligen Mutation im Bereich der IE1-Sequenz, die im weiteren Verlauf mit Hilfe der neuartigen BAC (bacterial artificial chromosome)-Technologie, also über homologe Rekombination mit infektiösen HCMV-BACmiden in Escherichia coli, die Generierung IE1-mutierter HCMV-Genome ermöglichten. Diese wurden anschließend zur Rekonstitution von Viruspartikeln in permissive, primäre humane Fibroblasten transfiziert. Aus der erfolgreichen Produktion BACmid-abgeleiteter Viren konnte bereits geschlossen werden, dass die punktmutierten IE1-Genprodukte für die HCMV-Vermehrung in Zellkultur nicht absolut notwendig sind. Eine Rekonstitution der vollständig IE1-defizienten Mutanten war hingegen nicht möglich, wahrscheinlich aufgrund eines IE1-unabhängigen negativen Effekts eines transdominant wirksamen Exon 2/3-kodierten Proteins oder einer inhibitorischen Wirkung der im Austausch für das Exon 4 integrierten Genkassette. Im nächsten Schritt zeigten detaillierte Replikationskinetiken in infizierten humanen Fibroblasten deutliche Unterschiede im Ausmaß der Vermehrungskapazität einzelner Virusmutanten auf. So zog die Störung des hochkonservierten zentralen Bereichs, einschließlich eines vermuteten Leucinzippermotivs, im IE1 des TN- und FIX-Stammes (Mutanten TN/FIX_L174P und TN/FIX_K192P) eine erheblich eingeschränkte Virusreplikation nach sich. Gleiches traf für C-terminal trunkierte IE1-Mutanten zu, denen charakteristische saure Domänen fehlten (Mutanten TN/FIX_A373Stopp und TN/FIX_E421Stopp). Dagegen spielte sowohl die Ausschaltung eines putativen Zinkfingermotivs (Mutanten TN/FIX_C279A) als auch der Verlust der Bindung an das SUMO (small ubiquitin like modifier)-1-Protein (Mutante TN/FIX_K450R) für eine effektive Virusvermehrung in Zellkultur keine Rolle. Für die Virusmutante G476_Stopp, bei der die am äußersten C-Terminus gelegene Chromatinbindedomäne des IE1-Proteins deletiert wurde, ergab sich für den FIX-Stamm eine Wildtyp-ähnliche, für den TN-Stamm jedoch eine leicht attenuierte Replikationskinetik, was Spekulationen über stammspezifische Unterschiede zulässt. Desweiteren konnte mit Hilfe immunfluoreszenzmikroskopischer Kolokalisationsstudien bewiesen werden, dass keine der eingeführten Punktmutationen für eine Kolokalisation zwischen IE1 und PML-Körpern erforderlich ist. Die Ausschaltung der SUMOylierung, der Chromatinbindung sowie des putativen Zinkfingermotivs zeigte außerdem keinerlei Einfluss auf die IE1-vermittelte Auflösung der PML-Körper. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass die Auflösung der PML-Körper in strikter Abhängigkeit des vermuteten Leucinzippermotivs erfolgt und auch bei Verlust der sauren Domänen oder Störung des zentralen Bereichs im viralen Protein weitgehend eingeschränkt ist. Schließlich wurde mit geeigneten Effektorplasmiden im Dual-Luciferase Reporter Assay nachgewiesen, dass die Transaktivierung verschiedener Promotoren durch IE1 deutlich abnimmt, wenn die Struktur des C-Terminus oder des vermuteten Leucinzippermotivs gestört ist. Die Transaktivatorkapazität des viralen Proteins war jedoch bei Verlust des putativen Zinkfingermotivs oder der SUMOylierung von IE1 unbeeinflusst. Auffälligerweise waren sämtliche Mutanten mit deutlichem Wachstumsnachteil gegenüber dem Wildtyp-Virus auch in ihrer Fähigkeit zur Auflösung der PML-Körper und in ihren Transaktivierungseigenschaften beeinträchtigt. Diese Beobachtung bestätigt, dass die Zerstörung der potenziell antiviralen PML-Körper eine mögliche Erklärung für den attenuierten Phänotyp IE1-mutierter Viren darstellt. Insgesamt verdeutlichen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass dem HCMV IE1-Protein eine wichtige Funktion im produktiven viralen Infektionszyklus zukommt, obwohl es, zumindest für die Virusvermehrung in Zellkultur, nicht absolut essenziell ist. Allerdings ist davon auszugehen, dass IE1-defiziente oder -mutierte Viren unter den stringenteren Bedingungen natürlicher HCMV-Infektionen des Menschen apathogen sind. In diesem Zusammenhang bieten sich IE1 und speziell einige der hier beschriebenen Sequenzmotive im IE1-spezifischen Exon 4 als potenzielle neue Zielstrukturen für antivirale Strategien an