Expression von ALR im HCC, Vergleich mit der ALR-Expression in gesundem und zirrhotischem Lebergewebe und Korrelation mit klinischen Daten

Hintergrund: Das Protein ALR (Augmenter of Liver Regeneration) gilt als ein wichtiger Faktor im Prozess der Leberregeneration und wurde ursprünglich als Homogenat aus sich regenerierenden Rattenlebern gewonnen. ALR wird in allen Zellen des menschlichen Körpers exprimiert, in großen Mengen findet es sich aber in der Leber und im Hoden. Bisher konnte gezeigt werden, dass in zirrhotischem Lebergewebe mehr ALR exprimiert ist als in gesundem Lebergewebe. Zusätzlich konnte eine erhöhte ALR-Expression auch im HCC nachgewiesen werden. Das Ziel dieser Arbeit bestand zum einen darin die Expression von ALR im HCC an einer höheren Fallzahl zu untersuchen und mit der Expression in gesundem Lebergewebe und in der Zirrhose zu vergleichen. Zum anderen wurde die Expression von ALR im HCC mit histomorphologischen, laborchemischen, klinischen Daten und Überlebensdaten korreliert. Material und Methoden: Material: Die Untersuchung der ALR-Expression erfolgte mittels Immunhistochemie. Als Material stand ein Tissue-micro-array (TMA) mit 233 Proben von HCCs, 163 Proben von Leberzirrhosen und 18 normalem Lebergewebeproben zur Verfügung. Außerdem konnten Paraffinblöcke von 53 HCCs, 28 Zirrhosen und 24 Normalgeweben genutzt werden, die mit Hilfe der Gewebedatenbank der Stiftung HTCR (Human Tissue and Cell Research) ausgewählt wurden. Zu allen diesen Gewebeproben existierte eine Datenbank mit klinischen Daten. Immunhistochemische Analyse der ALR-Expression: Die Immunhistochemie wurde mit einem DAKO Envision System mit einem polyklonalen Antikörper gegen humanes ALR aus dem Kaninchen (0,16 mg/ml) durchgeführt. Im Detail wurden von den Paraffinblöcken Schnitte von 2 μm Dicke angefertigt und diese auf Objektträger aufgezogen, der TMA war bereits auf einem Objektträger aufgezogen. Zunächst wurden die Schnitte und der TMA entparaffiniert und mittels einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert. Danach erfolgte eine Antigendemaskierung mit Proteinase K. Anschließend erfolgte das Auftragen eines 3-prozentigen humanen Serums. Nun wurde der Primärantikörper gegen humanes ALR aus dem Kaninchen (Verdünnung 1:600) auf die Schnitte und den TMA aufgetragen und bei 4°C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Schnitte und der TMA mit PBS gewaschen und anschließend als sekundärer Antikörper ein Maus-anti-Kaninchenantikörper aufgetragen. Nach 1 Stunde Inkubationszeit wurde der Sekundärantikörper erneut mit PBS abgewaschen. Nun wurde ein Ig-Maus-Antikörper aus dem Kaninchen auf die Proben aufpipettiert und nach einer einstündigen Inkubation erneut mit PBS abgewaschen. Als nächster Schritt wurde der APPAP-Komplex aus der Maus auf die Schnitte und den TMA aufgetragen und für 30min inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS wurde die Färbung durch das Inkubieren der Proben mit Fast Red Chromogen für 20min vervollständigt. Zuletzt wurden die Schnitte mit Hämatoxylin zur Kernfärbung gegengefärbt. Die Negativkontrollen wurden an den Proben mit einem Kaninchenantikörper anstelle des Primärantikörpers gegen ARL durchgeführt. Auswertung des Färbeergebnisses der Immunhistochemie: Die Auswertung des immunhistochemischen Färbeergebnisses der Schnitte und des TMA erfolgte durch einen Pathologen. Als positiv wurde die Proben beurteilt, wenn eine rote zytoplasmatische Färbung der Zellen vorlag. Die Anzahl der positiven Zellen wurde in Prozent angegeben und in 5 Gruppen eingeteilt: 0, 25-50%; 3, >50-75%; 4, >75%. Die Intensität der Färbung wurde in 4 Gruppen eingeteilt: 0, negativ; 1, schwach positiv; 2, mäßig positiv; 3, stark positiv. Anschließend wurde ein Gewebe-Label-Index gebildet, indem die Werte der Intensität und Anzahl der positiven Zellen multipliziert und in 3 Gruppen eingeteilt wurden: 0, negativ; 1-5, positiv; 6-12, stark positiv. Ergebnisse: In den durchgeführten Negativkontrollen zeigte sich keine rote Anfärbung, so dass die rote Färbung als spezifisch für die ALR-Expression angesehen werden konnte. ALR konnte durch die immunhistochemische Färbung im Zytoplasma von Hepatozyten im normalen und zirrhotischem Lebergewebe und in den Zellen des HCC in Form von roten Granula nachgewiesen werden. Positiv für ALR zeigten sich auch Gallengangszellen in den Portalfeldern, während sich in nichtparenchymalen Leberzellen keine Färbung zeigte. Eine statistische Auswertung des Arrays erfolgte nicht, da sehr viele der sich darauf befindenden Proben nicht ausgewertet werden konnten, da kein Leberparenchym vorhanden war oder dies nicht vital war und zudem die klinischen Daten sehr unvollständig waren. Bei der Auswertung der Gewebeschnitte mittels des Gewebe-Label-Index konnte gezeigt werden, dass signifikant (p<0,0001) mehr ALR im HCC und in der Zirrhose vorhanden ist als im normalen Lebergewebe. Weiterhin zeigte sich, dass in hepatozellulären Karzinomen, bei denen eine Angioinvasion vorlag, signifikant weniger (p