Biochemische Analyse der Dimerisierungseigenschaften der Bestrophine und molekularbiologische Charakterisierung des VMD2-Promotors

Vitteliforme Makuladystrophie Typ 2 (VMD2; OMIM #153700) ist eine autosomal dominante Erkrankung, die durch Mutationen im VMD2-Gen verursacht wird. Charakteristische Krankheitsmerkmale sind Eidotter-ähnliche Läsionen im Bereich der Makula, die eine Atrophie des retinalen Pigmentepithels (RPE) sowie der Netzhaut bedingen und im progredienten Krankheitsverlauf zum zentralen Visusverlust führen können. Das Genprodukt von VMD2, das Bestrophin-1-Protein, wird überwiegend im RPE exprimiert und definiert mit den paralogen Bestrophinen 2-4 die humane Bestrophinfamilie. Das integrale Membranprotein Bestrophin-1 fungiert wahrscheinlich als Ca2+-abhängiger Chloridkanal oder als ein Regulator der Ca2+-Homöostase in RPE-Zellen. VMD2-Mutationen sind außerdem noch mit drei weiteren seltenen erblichen Augenerkrankungen assoziiert, der Adulten Vitteliformen Makuladystrophie (AVMD; OMIM #608161), der Autosomal Rezessiven Bestrophinopathie (ARB; OMIM #611809) und der Autosomal Dominanten Vitreoretinochoroidopathie (ADVIRC; OMIM #193220). Bei ADVIRC zeigt sich abweichend von den anderen Erkrankungen als klinisches Bild unter anderem Nanophtalmos, was über eine zusätzliche Funktion von Bestrophin-1 in der okulären Entwicklung spekulieren lässt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der molekularen Wirkungsweise von Bestrophin-1 genauer charakterisiert, um die pathologischen Mechanismen von VMD2-assoziierten Erkrankungen besser verstehen zu können. Zu diesem Zweck wurden in-silico-, in-vitro- und in-vivo-Analysen zur Protein-Dimerisierung, der Expression und dem RNA-Spleißen durchgeführt. Mit Hilfe eines ToxR-basierten Dimerisierungsassays und eines MalE-basierten Membranintegrationsassays wurden die 6 putativen TMD der Bestrophine 1-4 bezüglich ihrer Dimerisierungseigenschaft und Membranintegration in einem biologischen Membransystem untersucht. Hierbei konnte bei allen Bestrophinen in drei von sechs TMD-Regionen Dimerisierung nachgewiesen werden. Bis auf eine leichte Abweichung bei Bestrophin-1 findet sich innerhalb der Bestrophin-Proteinfamilie ein einheitliches Dimerisierungmuster der beteiligten TMD. Zusätzlich wiesen 6 der 28 untersuchten Bestrophin-1-Mutationen ein signifikant verändertes Dimerisierungsverhalten im Vergleich zu den wildtypischen TMDen auf. Die ergänzenden Membranintegrationanalysen zeigten ein einheitliches Muster bei Bestrophin-1-4 und unterstützen somit das postulierte Topologiemodell, bei dem vier von sechs TMD membrandurchspannend sind. Mit einem unabhängigen Versuchsansatz wurde die Bestrophin-1-TMD-Dimerisierung mit rekombinant exprimierten Fusionsproteinen in einem in-vitro-Detergenzien-Mizellen-Dimerisierungsassay analysiert. Auch hier konnte für Bestrophin 1, für TMD1 und TMD5 Homodimerisierung nachgewiesen werden. Zwei von neun analysierten pathologischen Mutationen zeigten in vitro abweichende Dimerisungseigenschaften. Die partielle Divergenz zwischen in-vivo- und in-vitro-Befunden kann durch die unterschiedlichen Eigenschaften von Detergenzien und biologischen Membranen erklärt werden; ein Effekt, der bereits bei der Analyse anderer Proteine beobachtet werden konnte. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mit zwei unabhängigen Versuchsansätzen ein Dimeriserungspotential der TMD der Bestrophinproteinfamilie nachgewiesen werden konnte. Für einen kleinen Teil der bekannten humanen Mutationen stellen veränderte Dimerisierungseigenschaften einen möglichen Pathomechanismus dar. In weitergehenden Analysen konnte ein neues proximales, sehr starkes VMD2 Promotorelement identifiziert und charakterisiert werden. SNPs in diesem Bereich können die VMD2-Promotoraktivität beeinflussen und bieten eine mögliche Erklärung für die starke Variabilität in der Penetranz und im Phänotyp bei VMD2-Patienten. Zusätzlich wurden Hinweise für eine zirkadiane Regulierung des VMD2 Promotors gefunden. Weitere pathologische VMD2-Mutationen konnten mit der Bildung von alternativen Transkripten durch Spleiß-Variation korreliert werden, die jetzt zusammen mit den klinischen Daten als Genotyp-Phänotyp-Korrelationen bei ADVIRC zu diskutieren sind. Auch wenn durch diese Arbeit die genaue Funktion von Bestrophin nicht vollständig aufgeklärt wurde, konnten vielfältige neue Ansatzpunkte für weiterführende Untersuchungen erarbeitet werden, wobei insbesondere ausgewählten Tiermodellen zukünftig eine wesentliche Rolle zukommen sollte