Die Wirkung eines dentalen Monomers auf die Expression von mitogen-aktivierten Proteinkinasen

Biologisch nachteilige Effekte kunststoffbasierter dentaler Füllungsmaterialien in eukaryontischen Zellen basieren in erster Linie auf molekularen Mechanismen der zellulären Reaktion. Die vermehrte intrazelluläre Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) als Folge einer Exposition von Zellen gegen dentale Monomere stört die zelluläre Redoxhomöostase. In der Folge werden beispielsweise in Zellen oraler Gewebe Signalwege aktiviert, die das Überleben von Zellen regulieren, wie die Phosphatidylinositol 3-Kinase (PI3-K) oder der Transkriptionsfaktor NFκ-B. Auch spezifische Funktionen von Zellen des Immunsystems werden durch Monomere beeinträchtigt. So können beispielsweise die MAPK-abhängige Expression von Oberflächenantigenen oder die Freisetzung pro- und antiinflammatorischer Zytokine nach Stimulation der Zellen mit dem Endotoxin Lipopolysaccharid (LPS) aus pathogenen Organismen inhibiert werden. Mitogen-aktivierte Proteinkinasen (MAPK) dienen, zusammengeschlossen zu Kaskaden, als eine Signalkette, der Steuerung der Homöostase in Zellen. Die MAP-Kinasen ERK1/2, JNK und p38 sind besonders gut erforscht. Sie haben Einfluss auf die Regulation von Signalwegen, die dem Überleben von Zellen dienen, oder aber in Zellen Apoptose induzieren. Sie steuern aber auch wichtige Zellfunktionen wie die Zellproliferation und sind für die Regulation der Immun- und Stressantwort von großer Bedeutung. Erhöhte Mengen an ROS beeinflussen diese MAP-Kinasen, wodurch es überwiegend zur Aktivierung der SAPK (Stress-aktivierte Proteinkinasen) JNK und p38, sowie zur Induktion von Apoptose kommt. Ziel dieser Studie war es, den Einfluss des Kunststoffmonomers TEGDMA auf die Aktivierung der MAP-Kinasen p38, JNK und ERK1/2 zu untersuchen. Von besonderem Interesse war die Kinetik dieser Aktivierung oder Inaktivierung. Schließlich sollte auch der zeitabhängige Zusammenhang zwischen der Aktivierung oder Inaktivierung der MAP-Kinasen und dem Übergang von Zellen in Apoptose diskutiert werden. Die experimentelle Durchführung erfolgte ausschließlich mittels der gut charakterisierten Makrophagenzelllinie RAW264.7. Die Zellen wurden dem Monomer TEGDMA (3 mM) und LPS und einer Kombination von TEGDMA/LPS für 15 und 30 Minuten sowie für 1, 2, 6 und 24 Stunden exponiert. Anschließend wurden die phosphorylierten MAPK und die Gesamtmenge an MAPK (phosphorylierte und nicht-phosphorylierte Form) mit spezifischen Antikörpern mittels Western Blot nachgewiesen. Als Maß der Aktivierung der MAPK wurde das Verhältnis der phosphorylierten MAPK und der Gesamt-MAPK errechnet. Die MAP-Kinasen p38, ERK1/2 und JNK unterschieden sich sowohl in Abhängigkeit von der Expositionszeit als auch in der Stärke der Aktivierung oder Inaktivierung. ERK1/2, p38 and JNK wurden unterschiedlich stark in Anwesenheit von LPS (0.1 µg/ml), und TEGDMA (3 mM) aktiviert. Die MAPK p38 wurde nach kurzen Expositionszeiten von 30 Minuten mit TEGDMA nur schwach um den Faktor 1,8 aktiviert, während eine Aktivierung von ERK1/2 und JNK unter gleichen Bedingungen gänzlich ausblieb. Nach einer Expositionszeit von 2 Stunden wurde p38 kaum aktiviert (Faktor 1,2). Die Phosphorylierung von ERK1/2 wurde durch eine zweistündige TEGDMA-Exposition inhibiert. Die MAP-Kinase JNK zeigte nach 2 Stunden Exposition keine Aktivierung oder Inaktivierung. Nach einer Expositionszeit von 6 Stunden fand sich bei p38 eine Aktivierung, die sich kaum von derjenigen nach 30 Minuten unterschied (Faktor 1,9 im Vergleich zu Faktor 1,8). Exponierte man Zellen jedoch für 24 Stunden TEGDMA, so zeigte sich ein enormer Anstieg der Aktivierung von p38 um den Faktor 15,1. ERK1/2 verhielt sich ähnlich. Auch hier wurde nach 6 Stunden keine nennenswerte Phosphorylierung beobachtet, jedoch wurde nach 24 Stunden auch eine Steigerung um den Faktor 15,1 erzielt. Die SAPK JNK wurde nach 6 Stunden Exposition gegen TEGDMA ebenfalls nicht aktiviert (Faktor 0,8). Im Unterschied zu p38 und ERK1/2 fand sich aber bei JNK nach 24 Stunden Exposition nur eine geringe Aktivierung um den Faktor 1,3. Analysen zur Induktion von Apoptose durch TEGDMA, die parallel zu den Nachweisen der MAPK durchgeführt wurden, zeigten einen Zusammenhang zwischen der Aktivierung der MAPK p38 und ERK1/2 und der TEGDMA-induzierten Apoptose. Hierbei stieg die Zahl der Makrophagen, die in Apoptose und Nekrose übergingen prozentual mit der Expositionszeit. Damit wurde eine Korrelation, wenn auch kein kausaler Zusammenhang zwischen der Aktivierung von MAPK und der Induktion von Apoptose durch TEGDMA gefunden. Die Genotoxizität sowie die Zytotoxizität des Monomers TEGDMA aber auch von HEMA (2-Hydroxyethylmethacrylat) in verschiedenen Zelllinien wurden durch frühere Arbeiten häufig nachgewiesen. Mit der Charakterisierung der Kinetik der Aktivierung von MAPK und der Korrelation zur Induktion von Apoptose in der vorliegenden Arbeit wurde ein weiterer Schritt zur Erklärung von Mechanismen der biologischen Wirkung dentaler Monomere geleistet. Es gilt nun den noch fehlenden kausalen Zusammenhang durch geeignete Forschungsansätze wie beispielsweise mittels pharmakologischer und genetischer Inhibitoren der hier diskutierten MAPK zu untersuchen