Nachweis Archaea-typischer Lipide in Bacteria über die Aufklärung der Funktion von AraM und PcrB aus Bacillus subtilis

Der Entwicklungsstand der Sequenziertechnik erlaubt mittlerweile die Entzifferung eines bakteriellen Genomes innerhalb weniger Tage. In der nun beginnenden post-genomischen Ära ist es eine der wichtigsten Herausforderung den Produkten der identifizierten Gene Funktionen zuzuordnen. In dieser Arbeit wurde zur Aufklärung der Funktion von Enzymen ein integrativer Ansatz verfolgt. Dabei wurden Methoden der Bioinformatik, Genetik und Mikrobiologie mit den analytischen Techniken der physikalischen Biochemie kombiniert. Als Kandidat zur Funktionsaufklärung wurde das (βα)8-Fass-Protein PcrB aus B. subtilis gewählt. PcrB hat hohe Ähnlichkeit zu einem Schlüsselenzym der archaeellen Membranlipidsynthese, der Geranylgeranylglycerin-Phosphat-Synthase (GGGPS), die die stereospezifische Kondensation von Geranylgeranylpyrophosphat (GGPP) und Glycerin-1-Phosphat (G1P) katalysiert. Ausgangspunkt für die Aufklärung der Funktion von PcrB bildete der Vergleich der Kristallstrukturen von PcrB und der GGGPS aus Archaeoglobus fulgidus (afGGGPS), aus dem G1P als ein Substrat auch von PcrB abgeleitet werden konnte. Mit AraM als Glycerin-1-Phosphat-Dehydrogenase konnte das G1P produzierende Enzym in B. subtilis identifiziert werden. Mit dessen Hilfe wurde unter Verwendung der Enzyme der Glycolyse aus 14C-markierte Glucose 14C-G1P synthetisiert und über Papierchromatographie präpariert. Mit dem markierten Substrat G1P konnte somit die Aktivität von PcrB in in vitro und in vivo Experimenten untersucht werden. Zum einen wurde damit in vitro die GGGPS-Aktivität von PcrB G1P-abhängig nachgewiesen. Um die Fähigkeit von PcrB zu untersuchen den Umsatz längerer Polyprenylpyrophosphate (C25-C30) als das bereits getestete C20-GGPP zu katalysieren, wurde diese Substrate über eine mutierte Polyprenylpyrophosphatsynthease ebenfalls synthetisiert. Es konnte gezeigt werden, dass PcrB diese ebenfalls umsetzen konnte. Im Vergleichsenzym afGGGPS konnte in einem ähnlichem Experiment die Funktion eines bislang nur postulierten Aminosäurerestes als essentiell für die Begrenzung der Substratlänge und damit der Spezifität von afGGGPS belegt werden. Um das native Substrat und das Produkt von PcrB in B. subtilis zu bestimmen wurden Inkorporationsversuche mit 14C-G1P durchgeführt. Verglichen wurde dabei der B. subtilis Wildtyp Stamm und ein genomischer knockout Stamms ΔpcrB. Nach Extraktion und Analyse über Dünnschichtchromatographie konnten drei mögliche hydrophobe Produkte von PcrB identi¬fiziert werden. Zur Steigerung der Signalstärke wurde pcrB in B. subtilis rekombinant exprimiert, über HPLC die drei Produkte nichtradioaktiv präpariert und über Massen¬spektrometrie und NMR-Spektroskopie identifiziert. Es konnte C35-Heptaprenylglycerinphosphat als das native Reaktionsprodukt von PcrB bestimmt werden. In der Zelle liegt dieses dephosphoryliert und zum Teil einfach bzw. doppelt acetyliert vor. Die entsprechende Prozessierung wird über zwei weitere, noch nicht näher charakterisierte Proteine geleistet. Über Zellfraktionierung wurde die Lokalisation der Produkte in der Zellmembran von B. subtilis nachgewiesen. Mit Hilfe von moleküldynamischen Rechnungen konnte eine Theorie für die Spezifität von PcrB für das Substrat Heptaprenylpyrophosphat formuliert werden. Diese geht von einer Fixierung des planaren Endes des Substrates über Stapelkräfte an ein spezifisches Tyrosin am Ende der Bindetasche aus. Zusammenfassend konnte damit zum ersten Mal Polyprenyl-Glycerin-1-Phosphat-Ether außerhalb der Domäne der Archaea nachgewiesen. Gestützt auf Sequenzvergleiche und in vitro Versuche ist davon auszugehen, dass die Ergebnisse auch auf die PcrB Enzyme anderer gram-positiver Bacillales zu übertragen sind. Eine mögliche Funktion der gefunden Heptaprenylglycerinderivate könnte in der Regulation der Membranrigidität oder der Adhäsion der Organismen an Oberflächen liegen. Diese Hypothesen sollen nun in Zusammenarbeit mit mikrobiologisch orientierten Arbeitsgruppen überprüft werden