Intrazelluläre Reninprozessierung

Das Renin- Angiotensin- System (RAS) ist eine Kaskade proteolytischer Aktivierungen deren biologischer Effektor, Angiotensin II, Blutdruck und Extrazellulärvolumen reguliert. Renin katalysiert dabei den rate limited step und gilt somit als Schlüsselenzym der Kaskade. Renin wird als inaktive Vorstufe Prorenin in den Juxtaglomerulären Zellen gebildet. Die Sekretionsrate aktivierten Renins wird an den jeweiligen physiologischen Bedarf angepasst. Die intrazelluläre Reninprozessierung ist damit maßgeblich an der Aufrechterhaltung und Funktionsfähigkeit des RAS beteiligt. Den ersten entscheidenden Schritt stellt hierbei die Glykosylierung dar. Obwohl bereits viele Teilaspekte der zellulären Reninprozessierung durch in- vitro und in- vivo Untersuchungen beantwortet wurden, blieb die Frage nach der Rolle der Glykosylierung für die endogene Aktivierung des Renin bislang offen. Dies ist sicherlich auch darauf zurückzuführen, dass bis heute kein Modell sowohl für optische als auch für biochemische Untersuchungen der Reninprozessierung zur Verfügung steht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es durch gezieltes Verpaaren von ausschließlich REN1 (glykosyliert) und REN2 (unglykosylierte) exprimierenden Mäusen ein in- vivo Modell zu etablieren, mit dessen Hilfe die intrazelluläre Prozessierung und Freisetzung von Renin in Abhängigkeit von dem jeweiligen Glykosylierungszustand des Renins charakterisiert werden kann. Dadurch konnte gezeigt werden, dass unter normotensiven Bedingungen die aktive Plasmareninkonzentration der homozygoten REN2- Tiere signifikant gegenüber den REN1- Tieren erniedrigt ist, aber gleichzeitig in diesen Tieren eine erhöhte Renin mRNA Expression vorliegt. In chronischen Stimulationsmanövern konnte sowohl in REN1-, REN1/ REN2- und REN2- Mäusen eine Erhöhung der Renin mRNA Expression und eine Steigerung Plasmareninaktivität - wenn auch auf unterschiedlichen Niveau – erreicht werden kann. Die Erhöhung der Sekretion von aktiven Renin in REN2- Mäusen fällt nach Kurzzeit- Stimulation bereits gegenüber den REN1- und REN1/ REN2- Mäusen deutlich geringer aus. Anhand der isoliert perfundierten Niere konnte gezeigt werden, dass selbst nach Stimulation kein aktives Renin aus den Nieren von REN2 Mäusen freigesetzt wird, sehr wohl aber aus Nieren von REN1 und REN1/REN2 Tieren. Es konnten demnach erstmals, im Zuge dieser Promotionsarbeit, gezeigt werden, dass das aus der Niere sezernierte unglykosyliertes Renin2 bei chronischen Bedingungen die Funktion des glykosylierten Renins übernehmen kann, jedoch nicht bei schnellen, kurzzeitigen Stimulationen des RAAS. Gleichzeitig wurde damit die Notwendigkeit der Glykosylierung des Renins für die Freisetzung aktiven Renins aus der juxtaglomerulären Zelle gezeigt. In einem weiteren Teil der Arbeit war es möglich ein in- vitro Modell zu etablieren, mit dessen Hilfe die Reninprozessierung auf zellulärer Ebene zukünftig optisch und biochemisch untersucht werden kann. In Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die immortalisierte JG- Zelllinie As4.1, die angefertigten Konstrukte nach transienter Transfektion verlässlich exprimiert und die Intensität der Fusionsproteine untereinander sich nicht aufgrund der eingeführten Mutationen unterscheiden. Der notwendige biochemische Nachweis der ReninEGFP- Fusionsproteine konnte durch optimierte Kulturbedingungen der Zellen sowohl im Lysat als auch im Überstand ermöglicht werden. Daher kann zukünftig - nach entsprechendem Bearbeiten der Proben - eine differenzierte Analyse der jeweiligen Stadien der intrazellulären Reninprozessierung erfolgen. Des Weiteren sollte im Rahmen dieser Arbeit die Reninvesikelbildung für optische Untersuchungen optimiert werden. Dies gelang durch den Einsatz des Zellzyklusinhibitors Olomoucine, welcher die Teilungsrate der immortalisierten Zelle verlangsamt. Es konnte damit eine deutlich verbesserte Ausbildung von intrazellulären Reninvesikeln erreicht werden. Die verbesserte Darstellung konnte dabei sowohl in der lebenden Zelle, durch den Einsatz des generierten Konstruktes pRenEGFP, als auch an fixierten Zellen durch spezifische Renin HRP- Färbungen, gezeigt werden. Durch dieses Manöver gelang es außerdem die Sekretionsrate aktiven Renins um einen Faktor 2 zu steigern. Die Voraussetzungen für die mikroskopischen Untersuchungen der Reninprozessierung konnten somit geschaffen werden