Mutationsanalyse und kinetische Untersuchungen zum Reaktionsmechanismus der Indolglycerinphosphat-Synthase aus Sulfolobus solfataricus

Die Indolglycerinphosphat-Synthase aus Sulfolobus solfataricus (sTrpC) ist ein gut charakterisiertes Enzym mit einer (βα)8-barrel Struktur, das den vierten Schritt der Tryptophanbiosynthese katalysiert. Dabei wird 1-(o-Carboxyphenylamino)-1-desoxyribulose 5-phosphat (CdRP) zu Indol-3-glycerinphosphat (IGP) umgesetzt, wobei es zur Freisetzung von Wasser und Kohlendioxid kommt. In früheren Untersuchungen wurden durch Mutationsanalysen die katalytisch essentiellen Reste ermittelt und Röntgenstrukturen von sTrpC mit CdRP, dem Substratanalogon reduziertes CdRP (rCdRP) und IGP aufgeklärt. Auf dieser Basis wurde ein Reaktionsmechanismus mit zwei Intermediaten formuliert. Außerdem konnte die niedrige katalytische Aktivität von sTrpC bei niedrigen Temperaturen durch eine Kombination aus Zufallsmutagenese und Selektion in vivo erhöht werden. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit sollten weitere Reste mit Bedeutung für die Stabilität und Funktion von sTrpC identifiziert werden. Dazu wurden zwei unterschiedliche Ansätze verfolgt. Zum einen wurde die Struktur von sTrpC mit der von TrpC aus Thermotoga maritima (tmTrpC) überlagert, welches eine deutlich höhere Aktivität und Stabilität besitzt. Auf der Basis dieser Superpositionierung wurden mittels gezielter Mutagenese einige Reste am aktiven Zentrum von sTrpC durch die äquivalenten Reste aus tmTrpC ersetzt. Zum anderen wurden auf der Basis eines bioinformatischen Ansatzes, der auf einem multiplen Sequenzalignment (MSA) sehr vieler TrpC-Sequenzen beruht, potentiell wichtige Reste in sTrpC identifiziert und durch den jeweils im MSA häufigsten ersetzt. Die sTrpC-Mutanten aus beiden Ansätzen wurden in Escherichia coli hergestellt, die rekombinanten Proteine gereinigt und ihre Aktivitäten und thermischen Stabilitäten mit denen des wildtypischen sTrpC (sTrpC-wt) verglichen. Steady-state kinetische Messungen zeigten, dass sich durch die Mutationen R64F bzw. S181A die Wechselzahl (kcat) von sTrpC leicht erhöhte bzw. stark verringerte, während alle anderen Austausche diesbezüglich nur sehr geringe Auswirkungen hatten. Dagegen führten die meisten der eingeführten Mutationen zu einer mehr oder weniger deutlichen Erhöhung der Michaeliskonstante für CdRP (KMCdRP). Die Ergebnisse sprechen für eine direkte oder indirekte Beteiligung von W8, R54, K55, R64, I133, L142, S181 und F230 an der Substratbindung. Während dies für W8 bekannt war und I133 als wichtig für die Produktbindung eingestuft worden war, war den anderen Resten bisher keine Bedeutung für die Ligandenbindung zugemessen worden. Thermische Inaktivierung ergab, dass der L187F Austausch zu einer deutlichen Erhöhung und die Mutationen I133A, I133E und 133D zu einer starken Erniedrigung der Halbwertszeit der Inaktivierung bei 75 °C führen. Die restlichen Austausche hatten nur geringe Auswirkungen auf die thermische Stabilität. Sowohl sTrpC-wt, als auch alle untersuchten Mutanten wiesen einen Knick im Arrhenius-Diagramm auf, der jedoch bei recht unterschiedlichen Temperaturen lag. Da Nah-UV und Fern-UV Circulardichroismus keine Hinweise auf temperaturinduzierte Konformationsänderungen von sTrpC-wt erbrachte, ist die beobachtete Nichtlinearität wohl auf eine Änderung des ratenlimitierenden Schrittes der Reaktion zurückzuführen. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieses Teils der Arbeit, dass die direkte Übertragung von Resten aus tmTrpC sich nicht zur Erhöhung der Aktivität und Stabilität von sTrpC eignet. Dagegen führte ein neuer bioinformatischer Ansatz zur Identifizierung wichtiger Reste des Enzyms, deren Bedeutung durch bisherige Analysen der Sequenz und Struktur des Enzyms nicht erkannt worden war. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Reaktionsmechanismus von sTrpC-wt durch pre-steady-state Untersuchungen mittels Stopped-flow Techniken kinetisch analysiert. Bindungsstudien mit dem Substratanalogon rCdRP zeigten, dass zwei unterschiedliche Konformere des Liganden mit verschiedenen Raten an das Enzym binden bzw. von ihm dissoziieren. Der Quotient aus den koffrCdRP und konrCdRP-Raten einer Spezie deckt sich mit der bei Gleichgewichtstitrationen ermittelten Dissoziationskonstante KDrCdRP. Durch Verdrängungsexperimente mit hohen Konzentrationen an Orthophosphat konnte der Wert für die Dissoziationskonstante des Produktes koffIGP ermittelt werden. Die Analyse von Single-turnover (STO) Messungen, bei denen CdRP durch einen Überschuss an sTrpC-wt zu IGP umgesetzt wurde, zeigte einen mehrstufigen Verlauf des beobachteten Fluoreszenzsignals. Die Analyse deutet auf mindestens zwei Intermediate hin und steht somit dem in der Literatur postulierten Mechanismus nicht entgegen. Jede der in den STO-Experimenten ermittelten Ratenkonstanten war jedoch, ebenso wie der durch Verdrängungsexperimente bestimmte koffIGP, deutlich größer als der in steady-state Messungen ermittelte kcat-Wert, weshalb der ratenlimitierende Schritt der Reaktion nicht endgültig identifiziert werden konnte