Molekulare Mechanismen der Regulierung der Expression von NF-κB-Zielgenen durch den LIM-Homöodomäne-Transkriptionsfaktor 1 Beta

Der LIM-Homöodomäne-Transkriptionsfaktor LMX1B spielt eine wichtige Rolle sowohl bei der Entwicklung als auch bei der Aufrechterhaltung von zahlreichen Geweben. So führen Mutationen im LMX1B-Gen zum Erscheinungsbild des Nagel-Patella-Syndroms, einer autosomal dominant vererbten Erkrankung, zu dessen typischen Charakteristika unter anderem fehlgebildete Fingernägel, fehlende Patellen sowie eine Nephropathie zählen. LMX1B-Knockout-Maus Studien konnten zwar mutmaßliche Zielgene von LMX1B identifizieren, jedoch ohne eine molekulare Charakterisierung bleibt es fraglich, ob es sich hierbei in der Tat um direkte Zielgene von LMX1B handelt. Bis zum heutigen Zeitpunkt ist wenig über den Mechanismus der Transkriptionsaktivierung von LMX1B sowie über die Signalwege, die LMX1B reguliert, bekannt. Am Lehrstuhl von Prof. Dr. Ralph Witzgall wurde erstmals gezeigt, dass LMX1B die Geninduktion von bestimmten NF-kB-Zielgenen wie z.B. IL6 oder IL8 in HeLa-Zellen aktiviert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekulare Wirkungsweise von LMX1B bei der Regulierung dieser NF-kB-Zielgene näher zu charakterisieren. Dafür wurde hauptsächlich ein spezielles zelluläres Expressionssystem verwendet, welches eine regulierbare Synthese von LMX1B unter Anwendung des Tet-off-Systems in HeLa-Zellen ermöglicht. Mit diesen LMX1B-produzierenden HeLa-Zellen wurden zunächst Lokalisationsstudien durchgeführt, um zu untersuchen, ob LMX1B möglicherweise indirekt im Zytosol regulierend auf die NF-kB Aktivität eingreift. Nachdem festgestellt wurde, dass LMX1B die Translokation von NF-kB in den Zellkern nicht erhöht, war von einer Aktivierung der Geninduktion auf nukleärer Ebene auszugehen. Dass NF-kB direkt daran beteiligt ist, konnten siRNA-Experimente demonstrieren, bei der spezifisch eine Untereinheit von NF-kB gehemmt wurde. Dieser Befund, zusammen mit weiteren Daten der Arbeitsgruppe zeigten schließlich, dass LMX1B und NF-kB nach jeweiliger Bindung an DNA funktionell kooperieren. Um die molekularen Mechanismen, durch welche LMX1B und NF-kB die Transkription von NF-kB-Zielgenen aktivieren, näher charakterisieren zu können, wurden Luciferase Reportergen-Assays durchgeführt, wobei IL6 als exemplarisches NF-kB-Zielgen verwendet wurde. So konnte zum ersten Mal an einem nativen Promotor gezeigt werden, dass LMX1B die Transkription eines NF-kB-Zielgens durch Bindung an das sogenannte FLAT-Element, welches bereits anderweitig als LMX1B-Bindungsmotiv vermutet wurde, aktivieren kann. Diese Assays führten zugleich zu der Annahme, dass ein gemeinsamer Kofaktor an der Transaktivierung beteiligt ist. Durch die Verwendung verschiedener LMX1B-Mutanten, die ebenfalls in Reportergen-Assays auf ihre Fähigkeit zur Transkriptionsaktivierung des IL6 Promotors getestet wurden, stellte sich heraus, dass sowohl die DNA-bindende Homöodomäne als auch die LIM-Domänen, im speziellen die LIM2-Domäne, von LMX1B hierbei essentiell sind. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit schließlich ein Modell der Regulierung von NF-kB-Zielgenen durch LMX1B in HeLa-Zellen aufgestellt werden. Bei diesem Modell kooperieren LMX1B und NF-kB auf Chromatinebene bei der Transaktivierung der NF-kB-Zielgene, wobei für eine maximale Transkriptionsaktivierung beide Transkriptionsfaktoren sehr wahrscheinlich einen gemeinsamen Kofaktor benötigen, den es jedoch noch zu identifizieren gilt. Somit konnte mit denen aus dieser Arbeit und den von der Arbeitsgruppe gewonnen Daten, die mittlerweile veröffentlicht wurden, erstmalig für LMX1B eine direkte Beteiligung an der Regulierung der Expression von NF-kB-Zielgenen in HeLa-Zellen demonstriert werden. Des Weiteren wurde die wichtige Erkenntnis gewonnen, dass eine funktionelle Interaktion zwischen dem LMX1B-Signalweg und dem NF-kB-Signalweg existiert. Jetzt kann in zukünftigen, auf dieser Arbeit aufbauenden Forschungen der Zusammenhang zwischen den hier gewonnenen Daten über LMX1B im HeLa-Zellsystem und dem Nagel-Patella-Syndrom beim Menschen gezeigt werden. Möglicherweise lassen sich diese neuen Einsichten über die molekulare Wirkungsweise von LMX1B zusammen mit NF-kB auch auf den Menschen übertragen