Beiträge zur Mikrochip-Elektrophorese

Der breiten Anwendung der Mikrochipelektrophorese für das Hochdurchsatz-Screening, dem Nachweis pharmazeutischer Moleküle oder in der Proteomforschung stehen derzeit der Mangel geeigneter Detektionstechniken wie auch die ökonomische Fertigung von Mikrofluidik-Chips mit günstigen Oberflächeneigenschaften für Proteintrennungen entgegen. Die vorliegende Arbeit liefert innovative Beiträge zur intrinsischen Fluoreszenzdetektion von Biomolekülen sowie der Entwicklung von Mikrofluidik-Bausteinen aus funktionalen bzw. hydrophilen Polymeren. Detektionsseitig wird die intrinsische Fluoreszenz von kleinen Aromaten und Proteinen untersucht. Diese ermöglicht die empfindliche Detektion ohne vorherige Fluoreszenzmarkierung und kann mittels einzelphotoneninduzierter Fluoreszenz mit Anregung im tiefen UV-Spektralbereich, oder alternativ als zweiphotoneninduzierte Variante mit Anregung im sichtbaren Bereich erfolgen. Die Auswirkung der Anregungsintensität im Hinblick auf die erreichbare Empfindlichkeit bei 266 nm ist sehr analytspezifisch. Während für die untersuchten homozyklischen Aromaten die Nachweisempfindlichkeit mit steigender Anregungsintensität zunimmt, sinkt die Sensitivität für indolhaltige Moleküle oberhalb von 100 µW Anregungsleistung durch Photobleichen wieder ab. Die Photostabilität von proteingebundenem Tryptophan ist deutlich höher als die von freiem Tryptophan. So konnte für elektrophoretisch getrennte Proteine ein Detektionslimit von jeweils 5 µg/mL erreicht werden. Potentielle Anwendungen der intrinsischen Fluoreszenzdetektion werden am Beispiel der Analyse psychoaktiver Wirkstoffe aus einer Banane sowie an der der effizienten Trennung und Detektion von Eiklar-Proteinen demonstriert. Für die zweiphotoneninduzierte native Fluoreszenz wird das Potenzial im Hinblick auf die Verwendung kostengünstiger Chipmaterialien evaluiert. Zu diesem Zweck wird ein Mikrochipelektrophorese-System mit Anregung bei 420 nm vorgestellt. Die Detektion kleiner Aromaten ist sowohl in UVC-transparentem Quarz- wie auch in UVC-intransparentem Glas- Chips möglich. Im direkten Vergleich der Daten ist der Messuntergrund im Glas leicht erhöht. Sogar in UVB-intransparenten PMMA-Chips ist die Detektion potenziell möglich, allerdings wirkt der Chip wie ein Hochpassfilter, so dass Emissionslicht unterhalb von 360 nm durch das Polymermaterial absorbiert wird. Von den Modellanalyten weist das Tryptophan die größte Emission im UVA-Bereich auf, daher wird Tryptophanlösung in PMMA detektiert. Durch die Miniaturisierung leistungsstarker Laser bzw. die bessere Verfügbarkeit von LEDs im UVC-Bereich werden Detektoren für die native Fluoreszenzdetektion von Proteinen mehr Bedeutung erlangen. Die Implementierung zeitkorrellierter und wellenlängenselektiver Datenakquisitionstechniken würde die Signalidentifizierung in komplexen Realproben erleichtern und die Sensitivität durch Diskriminierung des Hintergrundes weiter steigern. Im Bereich der funktionalen Polymere liefert diese Arbeit tiefere Einblicke zum Verständnis der Oberflächenhydrophilierung von Polyvinylacetat, welches sich an der Oberfläche in kovalent gebundenen Polyvinylalkohol konvertieren lässt. Da eine direkte Fertigung von Polyvinylalkohol-Chips bis heute nicht möglich war, sollten so die vorteilhaften Eigenschaften von Polyvinylalkohol-Oberflächen für die MCE genutzt werden. Die Eignung der hydrophilierten Chips liegt jedoch aufgrund schlechter physikalischer Eigenschaften des Materials deutlich hinter den Erwartungen. Aus diesem Grund wird die softlithographische Strukturierung und Fertigung mikrofluidischer Chips in Schichtbauweise erprobt (�Sandwich�-Chips). Dieses Verfahren ermöglicht erstmals die direkte Herstellung von Chips mit strukturierter Polyvinylalkohol-Schicht, welche thermisch immobilisiert werden kann. Vorteile dieser Sandwich-Chips sind gute Transmissionseigenschaften bis 250 nm sowie die effiziente Ableitung Joulescher Wärme im Vergleich zum Polymer-Vollmaterial. Das direkte Herstellen hydrophiler Polymerchips für die Analyse biologischer Makromoleküle ist ein Novum, welches mit bestehender Infrastruktur in vielen Forschungslabors durchgeführt werden kann. Damit eignet es sich zum rapid prototyping und ist eine ökonomische Alternative zu nachträglich oberflächenmodifizierten Glas-Chips. Die Messung von Applikationen in diesen Bausteinen steht noch aus. Die Substituierung von konventionellem Glas zu fused silica als Trägermaterial sollte die Detektion von Proteinen mittels nativer Fluoreszenzdetektion mit Anregung im tiefen UV in Sandwich-Chips ermöglichen