Die Rolle der Aktivierung des Lymphotoxin beta Rezeptors (LTbetaR) bei Angiogenese und Tumorwachstum

Der Lymphotoxin beta Rezeptor (LTbetaR), ein Mitglied der TNF-Rezeptorfamilie, interagiert funktionell sowohl mit dem auf aktivierten B-, T- und NK-Zellen exprimierten Liganden LTalpha1beta2 als auch mit LIGHT. Bisherige Arbeiten haben gezeigt, dass die Stimulierung des LTbetaR auf Maus-Fibrosarkomzellen (BFS-1) zu einer NFkB-Aktivierung und zur erhöhten Expression von proangiogenem MIP-2 führt. Dadurch kommt es zu einer erhöhten Angiogenese und zu einem verstärkten Tumorwachstum in vivo. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die molekularen Mechanismen zwischen der Aktivierung des LTbetaR, der Induktion von proangiogenem MIP-2 und dem verstärkten Tumorwachstum in einem syngenen Tumormodell der Maus untersucht. Dazu wurde zunächst versucht, die LTbetaR Expression auf den Maus-Fibrosarkomzellen mittels short hairpin-(sh)-RNA herunter zu regulieren. Durch eine stabile Transfektion der Fibrosarkomzellen mit einem spezifischen, gegen den mLTbetaR gerichteten shRNA-Vektor konnte die LTbetaR-Expression auf 15 % der Zellen verringert werden. Nach der Stimulierung des LTbetaR auf den transfizierten Fibrosarkomzellen konnte jedoch keine Verminderung der NFkB-Aktivierung und der Expression von proangiogenem MIP-2 nachgewiesen werden. Weiterhin wurde untersucht, welcher der beiden NFkB-Signalwege in den Fibrosarkomzellen nach der Stimulierung des LTbetaR bei der Induktion von proangiogenem MIP-2 aktiviert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass nach LTbetaR-Stimulierung sowohl der klassische als auch der alternative NFkB-Signalweg in den Fibrosarkomzellen aktiviert wird. Nach der stabilen Transfektion der Fibrosarkomzellen mit spezifischen NFkB-Inhibitoren, die den klassischen NFkB-Weg (IkBalpha Superrepressor) oder den alternativen NFkB-Weg (dominant-negative Form von NIK oder NIK DN) hemmen, wurde die MIP-2-Expression in Abhängigkeit der beiden Signalwege untersucht. Die mit den NFkB-Inhibitoren transfizierten Fibrosarkomzellen exprimieren stark verminderte Mengen an proangiogenem MIP-2, zeigen eine Beeinträchtigung bei der Rekrutierung der NFkB-Proteine Rel A, Rel B, p50 und p52 und zeichnen sich auf syngenen C57BL/6-Mäusen im Vergleich zu Kontrollzellen durch ein stark verringertes Tumorwachstum aus. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass bereits die Hemmung eines der beiden NFkB-Signalwege ausreicht, damit das Tumorwachtsum in vivo vermindert ist. Die im BFS-1-Tumormodell der Maus erhaltenen Ergebnisse bezüglich der LTbetaR-Expression und -Aktivierung wurden an humanem Biopsiematerial sowie an entsprechenden humanen Tumorzelllinien überprüft. Dazu wurden zunächst Antikörper gegen den huLTbetaR mit Hilfe der Hybridomtechnik hergestellt. Nach der Expression der rekombinanten extrazellulären Domäne des huLTbetaR in E.coli und der Immunisierung von Balb/c-Mäusen konnten drei monoklonale Antikörper produzierende Hybridome (4D6, 8A8 und 13H6) stabil etabliert werden. 4D6 kann im Dot Blot und 8A8 im Western Blot zum Nachweis des LTbetaR verwendet werden. Außerdem besitzt der Klon 8A8 antagonistische Wirkung. Für die Analyse von Zellen im Durchflusszytometer ist der Hybridomklon 13H6 geeignet. Jedoch zeigte keiner der anti-huLTbetaR monoklonalen Antikörper eine agonistische Wirkung in Bezug auf die Aktivierung des NFkB-Signalwegs oder die Induktion von proangiogenem IL-8, welches im humanen System das funktionelle Homolog zum MIP-2 in der Maus darstellt. Die Expression des LTbetaR in primären humanen Tumorgeweben, wie Kolon- und Ovarialkarzinomen, konnte mit Hilfe eines anti-huLTbetaR monoklonalen Antikörpers (Klon 3G10H3) nachgewiesen werden. In Stimulierungsexperimenten, die mit primärem postoperativen Kolon- und Ovarialkarzinomgeweben durchgeführt wurden, konnte weder mit Hilfe der quantitativen PCR noch mittels ELISA eindeutig eine Induktion der IL-8 Expression nach LTbetaR-Stimulierung beobachtet werden. Aus diesem Grund wurden für weitere Stimulierungsexperimente humane Kolon- und Ovarialkarzinomzelllinien verwendet. Dabei zeigte sich, dass die IL-8-Expression in zwei der sechs untersuchten Kolonkarzinomzelllinien (HCT 116 und LoVo) und in drei der vier getesteten Ovarialkarzinomzelllinien (SK-OV-3, OVCAR-3 und Caov-3) durch die Stimulierung mit LIGHT induzierbar ist. In jeweils einer Kolon- (LoVo) und einer Ovarialkarzinomzelllinie (Caov-3) konnte durch Stimulierung mit agonistischem anti-huLTbetaR Antikörper eine IL-8-Expression induziert werden. Durch die Hemmung des klassischen (IkBalpha Superrepressor) oder des alternativen (NIK DN) NFkB-Signalwegs konnte zudem eine Verringerung der IL-8-Expression nachgewiesen werden. Damit konnte gezeigt werden, dass es nach der Stimulierung des LTbetaR zu einer Aktivierung beider NFkB-Signalwege kommt, die für eine induzierte IL-8-Expression in den untersuchten humanen Kolon- und Ovarialkarzinomzelllinien verantwortlich sind