Molekulargenetische Untersuchungen zur Expression von Sequenzveränderungen im REP-1-Gen bei heterozygoten Trägerinnen

Chorioideremie (CHM) ist eine X-chromosomal rezessiv vererbte Augenkrankheit. Charakteristisch für die Krankheit ist die progressive Degeneration der Photorezeptoren, des retinalen Pigmentepithels (RPE) und der Choriokapillaren (CHC) als Folge von Mutationen im REP-1 Gen. Hemizygote Männer klagen in der ersten oder zweiten Lebensdekade über Nachtblindheit, gefolgt von progredienten Gesichtsfeldausfällen, verminderter Sehschärfe und geringer Myopie. In höherem Alter zeigt die Mehrheit der untersuchten Patienten mit CHM ein gutes zentrales Sehvermögen. Im Endstadium kommt es zu einer zunehmenden Verminderung der Sehschärfe und des zentralen Sehvermögens. Frauen als Konduktorinnen (heterozygot) zeichnen sich durch ein meist asymptomatisches Krankheitsbild aus. Sie weisen jedoch deutliche Veränderungen in Form einer mottenfraß-ähnlichen, gefleckten Pigmentveränderung in der Peripherie des Fundus auf. Die feingranuläre Hyperpigmentierung und manchmal Atrophie des RPE deuten auf einen Gendefekt eines X-chromosomalen REP-1 Gens hin. Das mosaikartige Muster der Netzhautpigmentierung kann auf die zufallsbedingte Inaktivierung des X-Chromosoms zurückgeführt werden (=Lyonisierung). Eine Funktionsstörung, bedingt durch eine vorwiegende Aktivität des mutierten Allels, führt zur stärkeren Ausprägung von CHM. Bei einigen Frauen kann dies im höheren Alter zu Nachtblindheit, Photophobie oder gelegentlich zur Einschränkung des Sehfeldes führen. Das zu untersuchende Patientengut bestand aus 5 Trägerinnen bekannter Sequenzveränderung auf dem REP-1 Gen. Drei Konduktorinnen zeigten pathogene Sequenzveränderungen, die zu einem vorzeitigen Translationsstop führen (Deletion, Insertion, Nonsensemutation). Zwei Probandinnen zeigen einen Polymorphismus in Form einer funktionsstabilen Missensemutation. Mit einer molekulargenetischen Untersuchungsreihe des REP-1 Gens sollte die Verteilungshäufigkeit ermittelt werden, inwiefern eine Trägerin für Sequenzveränderungen des REP-1 Gens den Wildtyp oder ein sequenzverändertes Allel in Lymphoblastoidzellinien exprimiert. Dazu wurden von Konduktorinnen mit bekannten pathogenen REP-1-Mutation und Probandinnen mit benignen Missense-Mutationen Einzelzellen aus EBV-transformierten Lymphoblastoidzelllinien isoliert und deren RNA über die RT-PCR auf die Expression des veränderten Allels untersucht. Die Fragmentanalyse mit dem ABI PRISM SNaPshot Multiplex Kit ermöglichte die Untersuchung des exprimierten Alleles auf qualitative und quantitative Weise. Dabei wurde ein zur Zielsequenz komplementärer Primer um ein einziges ddNTP verlängert, welches komplementär zum SNP war. Die fluoreszent markierten Primer wurden kapillarelektrophoretisch der Größe nach aufgetrennt. So konnte die die Expression der Allele untersucht werden. Durch eine Verdünnungsreihe von Kontrolltemplates konnte nachgewiesen werden, dass die eingesetzte Methodik (sowohl die PCR, als auch die Kapillarelektrophorese) quantitativ arbeitet. Für die eigentliche Untersuchung wurden je Zellkultur 10 Zellen gewonnen. Für Probandin 38.2 wurde in den 10 untersuchten Zellen zu 100 % die Mutation exprimiert. Diese Zellen wiesen eine Restaktivität des inaktivierten X-Chromosoms von ca. 1,1 % auf. Bei Probandin 38.4 wurde auch zu 100 % die Mutation exprimiert. Zu ca. 4 % konnte eine Restaktivität für den Wildtyp nachgewiesen werden. Konduktorin 673.1 exprimierte in den untersuchten Zellen zu 90 % den Wildtyp mit einer Restaktivität von 4 % für die Mutation. In den restlichen 10 % der Proben in denen die Mutation exprimiert wurde, konnte keine Restaktivität für den Wildtyp nachgewiesen werden. Bei Konduktorin 716.1 kam es zu einer gleichmäßigen Verteilung der Allele mit Mutation und Wildtyp. Die Zellen in denen der Wildtyp exprimiert wurde, hatte das inaktivierte X-Chromosom mit der Mutation eine Restaktivität von 20 %. Die andere Hälfte der Proben, in denen vorwiegend die Mutation exprimiert wurde, wies im Durchschnitt eine Restaktivität von 34 % für den Wildtyp auf. Bei diesen 10 Zellen griff die Lyonisierung nicht, sondern es kam zu einem erhöhten Maß an Restaktivität. Durch ein vorzeitiges Stopcodon in Exon 6 bei Konduktorin 617.3, konnte durch den NMD (= nonsense mediated decay) kein PCR-Produkt hergestellt werden. Als Fazit konnte die These von Carrel et al. bestätigt werden, dass humane X-gebundene Gene (hier REP-1 Gen) der X-Inaktivierung entkommen können und daher sowohl vom aktiven als auch vom inaktivierten X-Chromosom exprimiert werden. In unserer Untersuchung konnte dies einerseits für Polymorphismen als auch für zwei pathologische Sequenzveränderungen (Deletion bzw. Insertion) gezeigt werden