Identifizierung und Charakterisierung von Beta-Defensin 14 der Maus

Beta-Defensine sind eine Familie kleiner, kationischer und amphiphiler Peptide mit einem Molekulargewicht von ca. 3-6 kDa. Sie werden hauptsächlich von Epithelzellen exprimiert und weisen antimikrobielle Aktivität gegen Bakterien, Viren und Pilze auf. Zudem aktivieren sie die Immunantwort, indem sie mittels CC-Chemokinrezeptor CCR6-abhängiger Chemotaxis Leukozyten rekrutieren. Die Beta-Defensinfamilie der Maus umfasst eine große Zahl an bisher meist nur auf genomischer Ebene identifizierter Gene. Erst wenige dieser Beta-Defensine wurden bisher synthetisiert oder rekombinant exprimiert und bezüglich ihrer biologischen Funktion untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nun erstmals das neue Beta-Defensin 14 der Maus (mBD14) als Ortholog des humanen Beta-Defensin 3 (hBD3) beschrieben werden. Entsprechend der Expression von hBD3 wurde die mRNA-Expression von mBD14 erstmals in verschiedenen Organen der Maus, darunter Trachaea, Lunge, Magen und Darm sowie in BMDCs nachgewiesen. Diese Expression wird durch die Stimulierung verschiedener Pattern-recognition-Rezeptoren wie z. B. Toll-like-Rezeptoren reguliert. Als weiterer intrazellulärer Pattern-recognition-Rezeptor wurde NOD2/CARD15 untersucht. Reportergen-Analysen zeigten, dass NOD2/CARD15-Aktivierung nach Stimulierung mit dessen Ligand MDP, einem Bestandteil des Peptidoglykans bakterieller Zellwände, zur Induktion der mBD14-Expression führt. Das für weitere funktionelle Untersuchungen hergestellte mBD14:Ig-Fusionsprotein zeigte in antimikrobiellen Assays die für die Beta-Defensin-Familie charakteristische antimikrobielle Aktivität gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien. Überdies wurde der Chemokinrezeptor CCR6 der Maus als potenzieller Rezeptor für mBD14 in HEK-293 Zellen exprimiert und anschließend die Bindung von mBD14:Ig an mCCR6 mittels durchflusszytometrischer Analysen nachgewiesen. In Chemotaxisversuchen mit hCCR6- oder mCCR6-exprimierenden HEK-293 Zellen sowie humanen PBMCs und residenten Peritonealzellen der Maus wurde eine speziesspezifische Interaktion von mBD14 und von mBD4 mit mCCR6 festgestellt. Im Gegensatz dazu zeigte sich, dass hBD2 und hBD3 sowohl mit mCCR6 als auch mit hCCR6 interagieren können. Zudem wurde die Bindung von mBD14:Ig an B-Lymphozyten, die endogen CCR6 exprimieren, nachgewiesen. Außerdem wurde gezeigt, dass auf Monozyten, die keinen funktionellen CCR6-Rezeptor exprimieren, noch ein weiterer chemotaktischer Rezeptor für Beta-Defensine exprimiert werden muss. Im BFS-1-Fibrosarkom-Tumormodell konnte nachgewiesen werden, dass die intratumorale mBD14:Ig-Expression das Tumorwachstum fördert, ohne jedoch das Wachstumsverhalten der BFS-1-Fibrosarkomzellen in vitro zu verändern. In Korrelation zu den Versuchen zur Interaktion von mBD14:Ig mit mCCR6 konnte gezeigt werden, dass der prozentuale Anteil an CCR6+ B220+ B-Lymphozyten in mBD14:Ig exprimierenden Tumoren, gemessen an der Gesamtheit tumorinfiltrierender Zellen, signifikant erhöht war. Anhand immunhistochemischer Untersuchungen wurde in mBD14:Ig-exprimierenden Tumoren ein erhöhter Anteil vaskulärer Gefäßstrukturen nachgewiesen, die eine Voraussetzung für das beobachtete verbesserte Tumorwachstum darstellen. Schließlich konnte mBD14 als neues Mitglied der Beta-Defensinfamilie identifiziert und charakterisiert werden. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass mBD14 nicht nur als antimikrobielles Peptid im Rahmen der angeborenen Immunabwehr eine wichtige Rolle spielt, sondern, dass mBD14 ebenso Einfluss nimmt auf antigenpräsentierende Zellen sowie auf Lymphozyten des adaptiven Immunsystems und somit immunmodulatorisch wirken kann