Berechnung der NMR-Struktur der PPARgamma-LBD und Hochdruck-NMR-Messungen an HPr I14A

In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Projekte durchgeführt. Zum einen wurde die Struktur der Ligandbindedomäne (LBD) von PPARg (Peroxisom-Proliferatoraktivierter Rezeptor gamma) mithilfe der NMR bestimmt und zum anderen die schon existierende Hochdruck-NMR-Apparatur weiterentwickelt und zur Untersuchung von HPr I14A, einer Mutante von HPr (histidine containing protein) von S. carnosus, verwendet. Strukturen von PPARg-LBD sind bis dato nur durch die Methode der Röntgenbeugung bestimmt worden. Um eine Struktur in nativer Umgebung zu erhalten, wurde die Ligandbindedomäne von PPARg mithilfe der NMR in Ab- und Anwesenheit des Liganden Rosiglitazon untersucht. In Abwesenheit des Liganden sind sie NMR-Spektren von PPARg austauschverbreitert und von so geringer Qualität, dass eine NMR-Strukturbestimmung nicht möglich ist. Nach Bindung von Rosiglitazon nimmt die Qualität der Spektren durch eine Verringerung der Linienbreite beträchtlich zu, so dass ca. 90 % der erwarteten Signale detektierbar werden. Für die Strukturrechnungen wurden 2352 Abstandsinformationen (gewonnen aus NOESY-Spektren), 439 Winkelinformationen (mithilfe des Programmes TALOS) und 225 Wasserstoffbrückeninformationen (entnommen aus den Röntgenstrukturen) verwendet. Eine Überlagerung der zehn energieärmsten Strukturen, von 1024 gerechneten, ergab für das Rückgrat einen RMSD von 0,179 nm und für alle Atome einen RMSD von 0,249 nm. Eine Verbesserung der Struktur konnte mithilfe einer Strukturverfeinerung in Wasser erreicht werden, welche die Interaktion zwischen Protein und Lösung berücksichtigt. Diese Verbesserung konnte vor allem in den Werten der Diederwinkel nachgewiesen werden. Um die NMR-Struktur weiter zu verbessern, wurde der in Regensburg entwickelte ISIC-Algorithmus eingesetzt, mit dessen Hilfe Informationen aus der Röntgenstruktur verwendet werden konnten. Durch die Anwendung dieses Algorithmus konnte eine in allen Bereichen gut definierte Struktur erhalten werden. Sowohl der RMSD (0,0189 nm für das Rückgrat) als auch die Diederwinkel (99,5 % in den erlaubten Bereichen des Ramachandran-Plotes) zeigten eine deutliche Verbesserung. Die aus der Literatur bekannten Röntgenstrukturen von freiem und ligandierten PPARg-LBD unterscheiden sich vor allem durch die Stellung der C-terminalen Helix H12. In der Struktur von PPARg-LBD, die mithilfe der NMR ermittelt wurde, nimmt diese Helix eine besondere Position ein: Sie befindet sich zwischen den beiden Positionen der Röntgenstruktur. Im Laufe dieser Arbeit wurden an den Hochdruckanlagen Umbauten und Weiterentwicklungen vorgenommen, um die Qualität der Anlagen zu verbessern. Diese betrafen u. a. den Berstschutz, den Autoklaven, die Behandlung der Quarz-Hochdruckzellen und Methoden zur Entlüftung der Anlagen. Durch diese Umbauten konnten sowohl die Sicherheit als auch die Handhabung der Anlagen gesteigert werden. Neben den statischen Druckuntersuchungen wurden erste Experimente mit einer NMR-Drucksprunganlage durchgeführt. Für Hochdruckmessungen wurde die Mutante von HPr I14A verwendet. Diese zeigte eine fast vollständige Denaturierung bei einem Druck von 2000 bar bei 318 K. Zusätzlich konnte eine Kältedenaturierung für HPr I14A bei 278 K und Normaldruck festgestellt werden. Bei 278 K und Normaldruck verschwindet in den Spektren das Signal der Referenzsubstanz DSS, was bei höheren Temperaturen gut beobachtbar ist. Dies legt nahe, dass im thermischen Gleichgewicht DSS in die durch die Mutation erzeugte Kavität bindet. Ein ähnliches Verhalten konnte bei der Druckreihe bei 278 K bis 200 MPa festgestellt werden. Auch hier ist ein scharfes DSS-Signal bei 200 MPa zu sehen. Aus den experimentellen Daten konnte die Gleichgewichtskonstante K für das Gleichgewicht zwischen nativ gefalteten und denaturierten Protein in Abhängigkeit von Druck und Temperatur bestimmt werden. Eine Anpassung der experimentellen Daten an ein Zweizustandsmodel erlaubte die Bestimmung der Änderung der freien Enthalpie G0, der Entropie S0, Wärmekapazität Cp, des molaren partiellen Volumens V 0, des thermischen Ausdehnungskoeffizienten alpha und des Produktes aus isobaren Kompressibilitätsänderung beta und dem partiellen Volumen V0. Bei 298 K erhält man ein G0 von 10,6 ± 0,3 kJ/mol, ein Cp von 12,5 ± 1,2 kJ/mol K, ein S0 von 0,16 ± 0,03 kJ/mol K, ein V 0 von -69,0 ± 10,5 mL/mol, ein alpha von 3,1 ± 1,7 mL/mol K und ein beta von 0,019 ± 0,006 mL/mol bar. Bei den 2D-1H, 15NHSQC- Experimenten an HPr I14A konnte für die Aminosäure Gly 13 zu hohem Druck hin (bei den gemessenen Temperaturen zwischen 278 K bis 318 K) eine Aufspaltung in zwei Signale beobachtet werden. Dies deutet auf einen langsamen Austausch mit einem gefalteten Zwischenzustand hin