Molekulare Mechanismen der Interferon-Resistenz humaner Zytomegalieviren

Wirbeltiere haben als Teil der angeborenen Immunabwehr im Laufe der Evolution ein höchst komplexes Interferon (IFN)-System entwickelt, welches das Potenzial besitzt Infektionen mit Viren und anderen Pathogenen zu unterbinden. Im Gegenzug dazu haben Viren wie das humane Zytomegalievirus (HCMV) zahlreiche Mechanismen entwickelt, die es ihnen ermöglichen der IFN-Antwort zu entkommen und im Wirtsorganismus zu persistieren. Die antivirale Immunantwort, die über Sekretion von Typ 1 IFN zur Induktion IFN-stimulierter Gene (ISG) führt, wird in zwei Phasen unterteilt. In Phase 1 lösen bereits die ersten Virus-Zell-Kontakte eine Reihe von molekularen Ereignissen aus, die in der Induktion des IFN-beta-Gens münden. Sezerniertes IFN-beta aktiviert dann, durch Bindung an seinen Rezeptor auf der Zelloberfläche, den so genannten janus kinase-signal transducer and activator of transcription (Jak-STAT)-Signaltransduktionsweg (Phase 2). Der im Kontext dieser Signalkaskade aus den Proteinen STAT1, STAT2 und IFN regulatory factor 9 (IRF9) gebildete trimere Komplex führt nach Phosphorylierung, nukleärer Translokation und sequenzspezifischer DNA-Bindung letztendlich zur transkriptionellen Aktivierung zahlreicher antiviraler Gene. Es wurde postuliert, dass mindestens ein unmittelbar nach Infektion neu synthetisiertes HCMV-Genprodukt die Induktion dieser ISG unterdrücken kann. Die ersten nach HCMV-Infektion produzierten viralen Genprodukte werden in der Klasse der immediate-early (IE)-Proteine zusammengefasst. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, inwiefern das virale 72kDa IE1-Protein diese Aufgabe übernimmt und welcher molekulare Mechanismus dieser Aktivität gegebenenfalls zugrunde liegt. Durch vergleichende Wachstumsanalysen mit einem Wildtyp-Virus und einer IE1-defizienten Virusmutante konnte zunächst gezeigt werden, dass die HCMV-Infektion in primären humanen Fibroblasten durch virusinduziertes IFN-beta normalerweise nicht limitiert wird. In Anwesenheit des IE1-Proteins zeigte das Virus auch eine ausgeprägte Resistenz gegenüber relativ hohen Konzentrationen an zusätzlich exogen zugesetztem IFN, während sich die IE1-spezifische Virusmutante als IFN-hypersensitiv erwies. Desweiteren wurde beobachtet, dass IE1 nur unwesentlich in die Phase 1 der IFN-abhängigen Immunantwort eingreift. Dagegen konnte gezeigt werden, dass das virale Protein die Induktion von mindestens zwei IFN-stimulierten, potenziell antiviralen humanen Transkripten im weiteren Verlauf der Infektion (Phase 2 der IFN-Antwort) effizient unterdrücken kann. Die reprimierenden Effekte von IE1 waren dabei unabhängig von anderen HCMV-Genprodukten. An Hand von Western Blot- und Immunfluoreszenz-Analysen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass das virale Protein weder die Gleichgewichtsmengen, noch den Phosphorylierungstatus oder die nukleäre Translokation von STAT1, STAT2 oder IRF9 negativ beeinflusst. Dagegen konnte mit Hilfe von subzellulären Fraktionierungsverfahren eine IE1-abhängige Retention von aktiviertem STAT1 und STAT2 im Zellkern nachgewiesen werden. Außerdem wurde eine spezifische Kolokalisation zwischen IE1 und den Komponenten des trimeren Komplexes im Zellkern beobachtet, die auf eine subnukleäre Sequestrierung und Delokalisation der zellulären Proteine durch IE1 hindeutet. Dementsprechend zeigten Chromatinimmunpräzipitationen, dass IE1 mit der sequenzspezifischen DNA-Assoziation von STAT1, STAT2 und IRF9 an Promotoren von ISG interferiert. Schließlich konnte durch Koimmunpräzipitationen aus infizierten Zellen und durch in vitro-Bindungsversuche eine physikalische Wechselwirkung zwischen dem IE1-Protein und STAT2 demonstriert werden. Während es sich bei der IE1-STAT2-Bindung vermutlich um eine direkte Wechselwirkung handelt, wurde für STAT1 eine indirekte Interaktion über STAT2 nachgewiesen. Zwischen IE1 und IRF9 war dagegen keine Bindung nachweisbar. Der für die physikalische Wechselwirkung mit STAT2 benötigte Bereich im IE1-Protein wurde auf eine 37 Aminosäuren umfassende Hauptinteraktionsdomäne im carboxyterminalen Abschnitt des viralen Proteins eingegrenzt. Für den zellulären Interaktionspartner erwiesen sich Abschnitte im aminoterminalen Bereich und in der zentralen DNA-Bindedomäne als kritisch für die Kolokalisation mit dem IE1-Protein. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals, dass die IFN-Resistenz des HCMV in maßgeblicher Weise durch das virale IE1-Protein bestimmt wird. Die Induktion IFN-induzierter antiviraler Gene wird dabei über einen einzigartigen intranukleären Mechanismus blockiert