Optimierung der Zuordnung mehrdeutiger NOESY-NMR-Signale unter Anwendung einer Datenbank nichtredundanter Proteinstrukturen

In der vorliegenden Arbeit wurde die Entwicklung des Softwarepakets AUREMOL fortgesetzt. Zentrales Ziel des Programms ist die automatische Strukturbestimmung unter Verwendung von möglichst wenigen experimentellen Daten. Kernziel der Arbeit war die Optimierung der automatischen Zuordnung von NOESY-NMR-Spektren durch Anwendung atomspezifischer Abstandsinformation, welche aus einer großen Datenbank nichtredundanter Proteinstrukturen gewonnen wurde. Unter Anwendung der NMR-Spektroskopie zur Strukturbestimmung, wird der Großteil der Information über interatomare Abstände im Protein aus NOESY-NMR-Spektren gewonnen. Sie stellen somit eine Schlüsselrolle bei der Strukturbestimmung dar. Ihre Auswertung gehört allerdings zu den zeitaufwendigsten und zugleich fehleranfälligsten Arbeitsschritten. Die Auswertung bzw. die Zuordnung der Spektren kann im Softwarepaket AUREMOL über das Programm KNOWNOE automatisch durchgeführt werden. Das Kernziel der Arbeit war in erster Linie die Zuordnung mehrdeutiger NOESY-Signale, die das Hauptproblem bei der Auswertung darstellen, zu verbessern. Mehrdeutige NOESY-Signale sind Signale, die aufgrund bekannter chemischer Verschiebungen nicht eindeutig einem bestimmten Atompaar zugeordnet werden konnten. Das im Programm KNOWNOE angewandte statistische Verfahren ist in der Lage, im Falle von zwei- oder drei unterschiedlichen Atompaaren als Zuordnungsmöglichkeit, die wahrscheinlichste Möglichkeit zu berechnen. Hierbei greift das Programm auf eine Datenbank aus Wahrscheinlichkeitsverteilungen zurück, die auf der Kenntnis interatomarer Atomabstände innerhalb bekannten Proteinstrukturen beruhen. Ziel war es, durch Ersatz der früheren Datenbank aus Verteilungen durch eine qualitativ hochwertigere und wesentlich umfangreichere Datenbank, die Anzahl so wie die Sicherheit der Zuordnungen zu erhöhen. Die neue Datenbank wurde im Gegensatz zur früheren Datenbank aus einem Satz strukturell nichtredundanter Strukturen erzeugt. Zusätzlich unterscheidet sie sich von der früheren Datenbank durch die größere Anzahl zu Verfügung stehender Verteilungen (über 200 000 anstatt 1577) für Abstände unterschiedlicher Atompaare, durch die höhere Datenauflösung (10 000 Datenpunkte anstatt 100) der einzelnen Verteilungen, durch die größere verwendete Strukturdatenbasis (1107 Strukturen anstatt 326) bei der Generierung und durch ein akkurateres mathematische Verfahren zur Berechnung einer bestimmten Verteilungskurve (Kurvenglättung über Summierung von Gaußkurven). Anhand der simulierten 2D-NOESY-NMR Spektren der Proteine TmCSP und HPr konnte gezeigt werden, daß unter Anwendung der neuen Verteilungen die Gesamtanzahl der erstellten Zuordnungen so wie deren Sicherheit bzw. Richtigkeit stark erhöht werden konnte. Insgesamt konnten bei vergleichbaren Versuchsbedingungen die Anteile der jeweils vorhandenen zwei- und dreideutigen NOESY-Signale, denen jeweils ein bestimmtes Atompaar mit einer hohen Wahrscheinlichkeit (z.B. 80-99%) zugewiesen wurde, in etwa verdoppelt werden. So konnten, unter Einsatz der neuen Datenbank, anstatt wie vorher etwa 20-25%, nun 40-55% der jeweils vorhandenen zwei- und dreideutigen NOESY-Signale ein bestimmtes Atompaar mit beispielsweise einer Wahrscheinlichkeit von mindestens 98% zugewiesen werden. Zugleich konnte der Anteil falsch zugewiesener Zuordnungen in der Regel um die Hälfte verringert werden. Dies ist besonders wichtig, da falsche Zuordnungen zu falschen Abstandsberechnungen führen, und dadurch zu einer Verzerrung des Strukturmodells bezüglich der wirklichen Konformation der fraglichen Proteinstruktur während der Strukturrechnung führen können. Die erreichte Minimierung falscher Zuordnungen zeigte sich besonders bei kleinen eingestellten Suchradien (<1.0 nm) im Programm KNOWNOE deutlich, da hierbei im Allgemeinen besonders viele falsche Zuordnungen auftreten. Der Suchradius ist ein Parameter im Programm KNOWNOE, der iterativ reduziert wird. Er gibt den maximalen Abstand an, den ein bestimmtes Atompaar innerhalb der bereits vorhandenen Modellstruktur haben darf, um als Zuordnungsmöglichkeit für ein bestimmtes NOESY-Signal in Frage zu kommen. So konnte der Anteil falsch zugeordneter zwei- und dreideutiger NOESY-Signale, unter dem relativ kleinen eingestellten Suchradius von beispielsweise 0,6 nm und einer eingestellten Wahrscheinlichkeitsgrenze von P=0,98 beim simulierten 2D-NOESY-Spektrum vom Protein CSP von 28,4 % auf 16,3% und beim Protein HPr von 24,5% auf 10,5% reduziert werden. Weiter konnte gezeigt werden, dass sich das hier angewandte statistische Zuordnungsverfahren bei Benutzung der neuen Verteilungen gegenüber Abstandsfehlern wesentlich toleranter verhält. So führten künstlich erzeugte Abstandfehler von beispielweise 30 % bei Anwendung der früheren Verteilungen zu erheblichen Schwankungen so wie Steigerungen der Anteile falscher Zuordnungen. Bei Benutzung der neuen Verteilungen blieben die Fehlerquoten hingegen weitgehend konstant. Dieses Ergebnis ist besonderes wichtig, da man in experimentellen NOESY-NMR-Spektren generell mit größeren Fehlern bei der Abstandbestimmung aus NOESY-NMR-Signalen rechnen muß. Es hat sich gezeigt, daß die ereichte Steigerung der Zuordnungsanzahl vor allem auf der großen Anzahl von erzeugten Verteilungen (über 200 000) beruht. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die stark erhöhte Datenauflösung von 10000 Datenpunkten. Die Verbesserung der Zuordnungssicherheit konnte hingegen im wesentlichem auf die größere benutzte Strukturdatenbasis, der geringen sequentiellen Ähnlichkeit (