Analyse kritischer Einflussfaktoren auf die Proteinexpression im zellfreien System

Die zellfreie Proteinexpression hat sich im Laufe der Zeit von einer Methode der Grundlagenforschung, primär angewandt bei der Aufklärung des genetischen Codes, zu einer sinnvollen präparativ anwendbaren Methode entwickelt. Verantwortlich dafür war zum einen die Entwicklung hochaktiver Lysate vor allem aus E. coli oder Weizenkeimlingen, zum anderen aber auch die Anwendung effektiver Transkriptionssysteme auf der Basis viraler Polymerasen und die Etablierung von effizienten Energieregenerationssystemen. Dadurch wurde es möglich, verschiedene Proteine in großen Mengen herzustellen. Jedoch besteht bei dieser Expressionsmethode das Problem, dass viele Proteine nur in einem unzureichenden Umfang exprimiert werden können. Gründe dafür sind unter anderem in der Unzugänglichkeit der frei vorliegenden mRNA und in der Wahl der verwendeten Codonen zu suchen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden deshalb Wege untersucht, um die Expressionsrate von ausgewählten Proteinen unter Verwendung von Lysaten aus E. coli zu erhöhen. Es wurde dabei versucht, zum einen das Expressionssystem selbst zu verändern, und zum anderen das Protein an die Gegebenheiten des auf E. coli basierenden Systems anzupassen. Bei der Anpassung des Systems selbst wurde versucht, durch den Zusatz von Kälteschockproteinen, die als RNA-Chaperone angesehen werden, das Niveau an Sekundärstrukturen auf der mRNA zu reduzieren. Denn solche Haarnadelschleifen können dafür verantwortlich sein, dass regulatorische Sequenzen, zum Beispiel Promotoren, dem Translationssystem nicht zugänglich sind und deshalb die mRNA nicht abgelesen werden kann. Entgegen dieser weit verbreiteten Hypothese konnte durch die Titration von CSPs zu der Expression von CAT bzw. Ras keine Erhöhung der Expressionsrate, sondern eine Inhibierung der Reaktion festgestellt werden. Eingehendere Untersuchungen haben ergeben, dass sowohl Transkription als auch Translation von dieser Hemmung betroffen sind und der beschriebene Effekt auf der Nukleotidbindung der CSPs beruht. Daraus konnte der Schluss gezogen werden, dass Kälteschockproteine keine verallgemeinerbare RNA-Chaperonaktivität besitzen, wie in der Literatur beschrieben ist. Desweiteren wurde untersucht, ob eine Anpassung der Gensequenz eines Proteins an das zellfreie E. coli Expressionssystem einen positiven Effekt auf die Expressionsrate haben kann. Dazu wurden von der Firma GENEART hergestellte Varianten des HIV-Capsidproteins p24 verwendet, die entweder die originale Virussequenz, eine auf die humanen Gegebenheiten hin optimierte Version und vor allem eine auf die Anwendung in E. coli hin optimierte Version verwendet. Dabei konnte festgestellt werden, dass eine Optimierung der Gensequenz deutliche Vorteile bei der Expression erbringt. Darüberhinaus wurde p24 an verschiedenen Stellen mit einer optimierten PTD-Domäne versehen. Die Variante des p24, die N-terminal mit einer PTD Domäne fusioniert wurde, konnte als optimal exprimierend und optimal in menschliche Zellen transduzierend beschrieben werden und ist somit der ideale Kandidat für die Etablierung einer Diagnoseprozedur für eine Vakzinierung gegen HIV. Weiterhin wurden Wege gesucht, um amyloid-beta Peptide im zellfreien System zu exprimieren. Nachdem festgestellt wurde, dass die Peptide alleine nicht nachweisbar exprimieren, wurden Alternativen gesucht. Die Anwendung von relativ kurzen Fusionstags N-terminal am Peptid erbrachte eine nachweisbare Expression. Je länger dieser Fusionspartner war, umso mehr Peptid konnte im Westernblot detektiert werden. Die Fusion von amyloid-beta Peptid mit CAT oder GST erbrachte hohe Ausbeuten. Die Präparation des Peptids ausgehend von diesen Fusionsproteinen konnte erfolgreich durchgeführt werden. Dazu wurde das Protein rückgefaltet und das Peptid durch Verdau mit TEV-Protease beinahe quantitativ freigesetzt. Die abschließende Aufreinigung durch Ni2+ Chelatchromatographie und RP-HPLC konnte das Peptid in Reinform darstellen, jedoch mit sehr hohem Verlust. Zusammenfassend betrachtet, konnte im Rahmen der Arbeit ein tieferes Verständnis der Funktion der bakteriellen Kälteschockproteine erreicht werden, sowie durch Genoptimierung eine Erhöhung der Expressionsrate von bestimmten Proteinen durchgeführt werden. Weiterhin wurde eine Methode entwickelt, um in einem System der zellfreien Proteinexpression stark aggregierende Peptide herstellen zu können