Untersuchungen zur Struktur, Funktion und Dynamik der Anthranilat-Phosphoribosyltransferase aus Sulfolobus solfataricus

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen der Struktur, der katalytischen Aktivität und der Dynamik von TrpD am Beispiel des homodimeren Enzyms aus dem hyperthermophilen Achaeon Sulfolobus solfataricus (ssTrpD) untersucht. Zunächst wurde in Kooperation mit Prof. Olga Mayans (Biozentrum der Universität Basel) die Röntgenstruktur des wildtypischen ssTrpD in Anwesenheit der beiden Substrate Anthranilsäure und PRPP gelöst. Es zeigte sich, dass pro Untereinheit im Grenzbereich der kleinen alpha helikalen und der großen alpha/beta Domäne zwei Moleküle Anthranilsäure und ein Molekül PRPP binden. Zusätzlich zu dem ausschliesslich durch die Pyrophosphat- und die Riboseeinheiten von PRPP komplexierten �Standard�-Mg2+-Ion (MG-1) fand sich in der Nähe der 5�-Phosphateinheit von PRPP ein zweites Mg2+-Ion (MG-2), das hauptsächlich von konservierten sauren Seitenketten (Asp223, Glu224) des Proteins gebunden wird. Um die Bedeutung einzelner Aminsoäuren der beiden Anthranilatbindetaschen I und II und der PRPP Bindetasche für die Substratbindung und die Katalyse zu überprüfen, wurde eine Reihe von Resten mittels gezielter Mutagenese ersetzt, in der Regel durch Alanin, im Fall von Asp223 und Glu224 durch die entsprechenden Amide. Die resultierenden ssTrpD Varianten wurden durch heterologe Genexpression in Escherichia coli hergestellt, gereinigt und durch steady-state enzymkinetische Messungen charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass keine der Substitutionen zu einer merklichen Verringerung der Wechselzahl (kcat) führte und damit keiner der ausgetauschten Reste für die Reaktion essentiell ist. Die Entfernung zwischen den beiden gebundenen Molekülen Anthranilat, AA I und AA II, und dem gebundenen PRPP beträgt in der Röntgenstruktur von ssTrpD 14,6 Å bzw. 8,6 Å, was eine Reaktion unmöglich macht. In Kooperation mit Dr. Dimitri Svergun (EMBL Hamburg) wurden Röntgenkleinwinkelstreuungsmessungen (SAXS) in An- und Abwesenheit der Substrate durchgeführt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass in ssTrpD durch die Bindung der Substrate eine Relativbewegung der beiden Domänen induziert wird, wodurch AA II und PRPP in einen reaktiven Abstand gebracht werden. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine Variante von ssTrpD mit den Austauschen Asp83Gly und Phe149Ser analysiert, die eine im Vergleich zum wildtypischen Enzym erhöhte katalytische Aktivität aufweist und in früheren Experimenten durch eine Kombination aus Zufallsmutagenese und Selektion in vivo isoliert worden war