Charakterisierung des zellulären Lipideffluxes von primären, humanen Fibroblasten und Monozyten/Makrophagen

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde das für Fibroblasten bereits etablierte System des spezifischen Lipideffluxes mit Apolipoprotein A-I (ApoA-I) auf von freiwilligen Spendern gewonnene Monozyten übertragen. Optimale Ergebnisse im spezifischen Lipidefflux wurden dabei nach einer viertägigen Differenzierung mit M-CSF, mit einer Zellzahl von 750.000 ausgesäten Monozyten sowie einer Beladung mit 40 µg/ml an enzymatisch modifiziertem LDL (E-LDL) erreicht. Der spezifische Lipidefflux betrug zwischen drei und acht Prozent für Cholesterin sowie zwischen drei und sechs Prozent für Phospholipide und war abhängig von den individuellen Unterschieden der jeweiligen Spender sowohl von Monozyten als auch von Plasma/E-LDL. Zur näheren Charakterisierung des Lipideffluxes wurden mit Hilfe einer massenspektrometrischen Quantifizierung von Lipiden für beide Modelle die Unterschiede in Zellen und Medien bezüglich der Lipidklassen sowie deren Speziesmuster aufgezeigt. In Schaumzellen, welche aufgrund der Beladung mit E-LDL zellulär einen bedeutend höheren Anteil an Cholesterinestern (CE) aufwiesen, zeigte sich ebenso wie in Fibroblasten eine durch ApoA-I induzierte und somit für ABCA1 spezifische Entladung von Phosphatidylcholin (PC), Sphingomyelin (SPM) sowie v. a. von freiem Cholesterin (FC). Auf der Ebene der PC-Spezies ergab sich dabei für beide Zellmodelle eine präferentielle Entladung von einfach ungesättigten PC-Spezies, insbesondere von PC 34:1. Ferner konnte mittels massenspektrometrischer Analytik unter Verwendung von 13C-Cholesterin während der Effluxphase mit HDL3 eine partielle Beladung der Zellen mit CE gezeigt werden. Ebenso wurden in Medien von Schaumzellen CE detektiert, deren Anteil sich in Medien sowohl mit ApoA-I als auch mit HDL3 steigern ließ. Dieser Efflux von CE war in Fibroblasten nicht zu beobachten und ist vermutlich auf eine Induktion von ApoE zurückzuführen. Um den Einfluss von Sphingolipiden auf den spezifischen Lipidefflux zu klären, wurden sowohl Fibroblasten als auch Schaumzellen in der Effluxphase mit verschiedenen Sphingolipiden inkubiert. Während Ceramid bei Schaumzellen stimulierend auf den ApoA-I spezifischen Efflux wirkte, wurde bei Fibroblasten eine konzentrationsabhängige hemmende Wirkung beobachtet. Darüber hinaus zeigten sich für Sphingosin und Sphingosin-1-Phosphat in Fibroblasten etwas stärker inhibierende Effekte auf den spezifischen Lipidefflux als im Modell mit Monozyten/Makrophagen. Um ferner eine potentielle Wirkung der Sphingolipide über PKC näher zu charakterisieren, wurde die Expression der PKC-Isoformen sowie deren Modulation durch Sphingolipide untersucht. Dabei konnte lediglich durch Phorbolmyristylacetat eine Hemmung des Lipideffluxes mit einer parallelen Downregulation der PKC-Isoformen epsilon, delta und zeta beobachtet werden. Somit könnte man von einer den spezifischen Lipidefflux modulierenden Rolle der PKC ausgehen, welche v. a. durch die Proteinmenge von PKC bestimmt wird. In Analogie zur Regulation des Sulfonylharnstoff-Rezeptors wurde ferner der Einfluss von Kalium-Kanal-Inhibitoren auf den spezifischen Lipidefflux untersucht. Bei der Inkubation der beiden Zellsysteme mit verschiedenen Kalium-Kanal-Inhibitoren zeigte sich nur für Glibenclamid ein einheitlich hemmender Effekt auf den spezifischen Lipidefflux. Darüber hinaus wurde ein deutlich ausgeprägter, hemmender Einfluss auf die zellulären CE-Konzentrationen während der Be- und Entladungsphase gefunden, welcher jedoch nicht mit dem Verhalten eines Inhibitors der Acetyl-CoA:Cholesterin-Acyltransferase (ACAT) vergleichbar war. Weiterhin wurde in Anlehnung an die Ergebnisse mit GIRK-Inhibitoren der Einfluss von Modulatoren purinerger Rezeptoren auf den spezifischen Lipidefflux untersucht. Die Modulatoren purinerger Rezeptoren zeigten hierbei nur schwache und im Vergleich der beiden Zelltypen stark unterschiedliche Wirkungen auf den spezifischen Lipidefflux. Der beobachtete hemmende Einfluss von Suramin sowie von Clopidogrel lässt auf unspezifische, nicht auf einer Hemmung purinerger Rezeptoren beruhende Effekte dieser Substanzen schließen, da auch Agonisten purinerger Rezeptoren teilweise inhibierende Effekte aufwiesen