Charakterisierung einer neuen Isoform des humanen p75TNF-Rezeptors

Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) spielt eine wichtige Rolle bei Entzündungen und Immunreaktionen, wobei TNF über zwei membranständige TNF Rezeptoren (TNFR), den TNFR1 (p55TNFR) und den TNFR2 (p75TNFR), wirkt. Während Aktivierung des p55TNFR klassische Apoptose-Signalwege induziert, ist über die zelluläre Auswirkungen einer Aktivierung des p75TNFR nur bekannt, dass das Adapterprotein TRAF2 rekrutiert wird, was wiederum NFkappaB induziert. Bei der Untersuchung des p75TNFR Promotors wurde eine neue Isoform dieses Rezeptors indentifiziert, die durch alternatives Splicing des 1. Exons entsteht. Durch diesen Splice- Vorgang wird das Signalpeptid durch eine Präsequenz ersetzt, die nach eingehender Datenbank Recherche nicht als Signalpeptid fungiert. Die somit resultierende Isoform wurde deswegen als �intracellular� (=ic)p75TNFR bezeichnet. Die genaue subzelluläre Lokalisierung, die Aktivierung durch den Liganden TNF und proteinchemische Charakterisierung des icp75TNFR sind Gegenstand dieses Projekts. Um Zellinien zu generieren, die jeweils eine der beiden Isoformen überexprimieren, wurde die Technik des retroviralen Gentransfers gewählt. Hierfür wurde die jeweilige cDNA in den proviralen Vektor pQCXIP kloniert, und ein Protokoll für die Virusproduktion und Infektion der Zielzellen etabliert. An den stabil transduzierten Zellinien wurden Antikörper gegen verschiedene Epitope des p75TNFR getestet um ein optimales Paar für die Immunpräzipitation zu finden. Im Western Blot stellte sich auf Proteinebene das icp75TNFR Gen-Produkt schwerer dar, was dafür spricht, dass die Präsequenz beim icp75TNFR nicht abgespalten wird, in Gegensatz zum Signalpeptid desp75TNFR, das bereits im ER abgespalten wird. Außerdem liegt vom icp75TNFR eine große Menge unglykosyliert vor, ein weiteres Indiz für intrazelluläre Retention des Proteins. Mit Zellen, die stabile eYFP- Fusionsproteine des jeweiligen Rezeptors exprimieren war es möglich Life cell imaging am Fluoreszenzmikroskop durchzuführen. Wie erwartet stellte sich der p75TNFR als vorwiegend membranständig dar, während der icp75TNFR punktuelle perinucläre Verteilung zeigte. Vereinzelt konnte mit time-lapse- Aufnahmen ein Transport dieser Vesikel zur Zellmembran beobachtet werden. Weitere Färbungen mit Kompartiment- spezifischen Farbstoffen weisen auf Kolokalisierung des icp75TNFR mit dem Golgi Apparat und Endosomen hin. Durchflusszytometerische Messungen zeigen Membranexpression für beide Isoformen, wobei der icp75TNFR jedoch in weit geringerem Ausmaß als die p75TNFR Isoform auf der Membran lokalisiert ist. Die Extrazellulärdomänen beider Isoformen werden MMP-abhängig und TNF-induzierbar im Zellüberstand mittels ELISA gefunden, wobei ebenfalls mehr löslicher p75TNFR von p75TNFR- transduzierten als von icp75TNFR- transduzierten Zellen entsteht