Elektrostatische Kraftübertragung und Kontrolle der Chemokinesis im Flagellenmotor von Sinorhizobium meliloti

Die Flagellen von Sinorhizobium meliloti rotieren im Gegensatz zu Escherichia coli-Geißeln nur im Uhrzeigersinn. Richtungsänderungen der schwimmenden Zelle werden durch Variation der Rotationsgeschwindigkeit einzelner Flagellen und eine daraus resultierende Auflösung des geordneten Geißelbündels erreicht. Der Flagellenmotor von S.meliloti enthält konservierte Komponenten, wie MotA, MotB, FliM, FliN und FliG. Darüber hinaus wurden neue Mot-Proteine, MotC, MotD und MotE identifiziert, die essentielle Spezifika des S.meliloti-Flagellenmotors (und verwandter) darstellen (Sourjik et al., 1998). Von diesen wurde hier das MotC-Protein analysiert. Es stellte sich aber heraus, daß die Verhältnisse bestimmter geladener AS-Reste an der Kontaktfläche von Protonenkanal (MotA) und Rotor (FliG) für das Rotationsmuster und folglich die Bewegung schwimmender S.meliloti-Zellen entscheidende Bedeutung haben. Deshalb wurde hier auf die genetische, protein-biochemische und funktionelle Untersuchung dieser Reste und ihre Wirkung besonderer Wert gelegt. Die wichtigsten Ergebnisse und Schlußfolgerungen dieser Arbeiten lassen sich wie folgt zusammenfassen: (1) Die unbekannten motA, motC und fliG-Sequenzen von Rhizobium lupini H13-3 wurden erschlossen, mit den bekannten Orthologen von S.meliloti, Agrobacterium tumefaciens und Mesorhizobium loti verglichen und auf diese Weise konservierte Domänen definiert. (2) Die periplasmatische MotC-Komponente stellt durch Bindung an das MotB-(Kanal-) Protein die Funktionsfähigkeit des energetisierenden Protonenkanals sicher. MotC dient möglicherweise als �Protonenfalle� oder �pmf-Sensor�, weil S.meliloti-Zellen bei höheren pH-Werten (bis pH 9,5) noch schwimmen als E.coli-Zellen (bis pH 9,0). Bereits früher identifizierte, im zentralen Bereich von MotC durch Deletionen hervorgerufene Funktionsdefekte wurden hier weitgehend auf die Instabilität der Mutantenproteine zurückgeführt. Deshalb müssen weitere Untersuchungen mit (stabilen) Substitutionen einzelner Reste im MotC-Protein durchgeführt werden. (3) Durch gezielte Mutagenese wurden 68 Einzel-, Doppel und Dreifachaustausche der konservierten geladenen Reste Arg90 und Glu98 (MotA) bzw. Arg294, Glu300, Ser301 und Asp302 (FliG) generiert und die Schwärm- und Schwimmfähigkeit der resultierenden Mutanten bestimmt. Aus den Resultaten lassen sich drei Mutantenklassen ableiten: a) Reste, die für die Flagellenrotation essentiell sind, weil ihr Ausfall die Aufhebung oder eine deutliche Reduktion der Rotationsgeschwindigkeit hervorruft. In dieser Kategorie sind Glu98 und Arg294 absolut notwendige geladene Reste, Arg90 und Asp302 haben geringeres Gewicht, ebenso die �neuen� (S.meliloti-spezifischen) Reste Glu300 und Ser301. b) Ladungsumkehr zwischen bestimmten Resten kompensiert die Defekte der Einzelmutationen (Suppression). Dies trifft für die Kombinationen Glu300Arg/Ser301Ala-Arg90Glu und Glu300Arg/Ser301Arg-Arg90Glu zu. Die Ergebnisse zeigen, daß elektrostatische (Coulomb-) Wechselwirkungen zwischen antagonistischen Ladungen entscheidend für die Kraftübertragung vom Stator (MotA) auf den Rotor (FliG) sind. c) Reste, welche die Chemokinesis (Geschwindigkeitserhöhung bei taktischer Stimulation) betreffen. Die Neutralisation der MotA-Reste Arg90 (Ala) und Glu98 (Gln) führte zum Verlust der Chemokinesis, teilweise auch eine Ladungsumkehr des FliG-Rests Asp302 (Lys). Folglich reicht eine MotA-FliG Coulomb-Wechselwirkung für die Aufrechterhaltung der Rotation mit hoher Geschwindigkeit aus, die Kombination von zwei wechselwirkenden Ladungspaaren ist aber für die Geschwindigkeitsvariation (�Bremse�) entscheidend. (4) Eine C-terminale Fusion von FliG mit dem MS-Ring (FliF) resultierte in reduzierter Geschwindigkeit und Chemokinesis. Dieser Befund wird als Beleg für eine eingeschränkte Fähigkeit von FliG zur Konformationsänderung interpretiert, die als Voraussetzung für die Geschwindigkeitsvariation gilt. (5) Aus den Daten wurde ein Funktionsmodell des S.meliloti-Motors etabliert, in dem die Coulomb-Wechselwirkungen zwischen MotA und FliG die entscheidende Rolle bei Rotation und Chemokinesis spielen