Structure and dynamics of unfolded proteins probed with advanced spectroscopic techniques and microfluidic mixing

The unfolded state has attracted increasing attention due to growing evidence for its importance for the regulation, function, stability, and folding of proteins. The analysis of the unfolded state has been hampered by its properties, as it comprises a distribution of rapidly interconverting configurations rarely populated under physiologically relevant conditions. In this work, two strategies are used to meet the demands of investigating unfolded proteins: in single-molecule fluorescence spectroscopy, the unfolded state can be monitored in the presence of the folded state. In kinetic experiments, the unfolded state can be populated transiently and analyzed in the conditions of interest prior to the start of the refolding reaction. The presented experiments are used to investigate the properties of the unfolded state of the cold shock protein (Csp) from Thermotoga Maritima under near-physiological conditions, where unfolded Csp has previously been shown to collapse. To understand the implications for the folding process, a more detailed picture of the structure of the collapsed unfolded state is needed. To this end, different variants of Csp were produced and labeled to measure internal Förster resonance energy transfer (FRET) in different parts of the protein. With single-molecule FRET spectroscopy, it could be shown that the distance distributions of all variants agree very well with a Gaussian chain model not only in the presence of high concentrations of denaturants but also in the collapsed state in near-physiological conditions. This observation suggests that there is no preferential collapse of one part of the chain, but that the compaction is rather uniform for the entire polypeptide. To quantify the secondary structure content in the unfolded state, a microfluidic mixing system was developed, making it possible to perform kinetic experiments with synchrotron radiation circular dichroism (SRCD) spectroscopy. This mixing device in combination with SRCD allows the wavelength range to be extended down to 205 nm, and the dead time to about 200 s, making it possible to monitor the secondary structure content during kinetic experiments at wavelengths and with a time resolution that are inaccessible with conventional stopped-flow techniques. The performance of the mixer was demonstrated by measuring the folding kinetics of cytochrome c, which showed good agreement with previously published results. Measurements of Csp indicated -structure content in the collapsed unfolded state of about 20% compared with its folded state. Such secondary structure could have significant influence on the subsequent folding process. This result, together with the findings from the single-molecule measurements, is an interesting contribution to the reconciliation problem, i.e. how the observations of random coil behavior from global properties such as the radius of gyration can be reconciled with findings of residual structure in unfolded molecules. Obviously, the existence of secondary structure does not have to affect the overall distance properties of unfolded chains, also under near-physiological conditions. A possible explanation is that the structured elements are rather short in sequence and/or only transiently populated, thus not affecting the overall distance distribution significantly. The structure in unfolded proteins is directly connected to the proteins’ dynamic behavior since the formation of structure requires the encounter of different parts of the chain. The dynamic properties are thus of great interest because they determine the time in which a protein can sample its conformational space and are therefore crucial for understanding both the unfolded state and the folding process. To this end, fluorescence intensity correlation functions for the unfolded subpopulations were measured in the presence of folded molecules with sub-nanosecond time resolution. The dead times of single detectors could be avoided by using a Hanbury Brown and Twiss detection scheme. The analysis of the photon statistics revealed the global reconfiguration time of the polypeptide chain that is about 50 ns for highly denatured Csp and increases with decreasing GdmCl concentrations. As the intrachain distances are available from FRET analysis, the relative diffusion coefficient D of the chain ends can also be calculated. It could be shown that D decreases concomitantly with chain collapse under near-physiological conditions. A decrease of D can be interpreted as an increase of intramolecular interactions due to changes in the packing and interaction of the polypeptide backbone and side chains. An example for those interactions could be the formation of secondary structure, as observed in the SRCD experiments. The end-to-end diffusion coefficients of Csp agree very well with results from short unstructured peptides, indicating the absence of strong and specific interactions and correspondingly large energy barriers in the collapsed unfolded state of Csp. Measurements of the Csp variants with different intramolecular distances showed a decrease of D with decreasing separation within the sequence, which might result from a viscous drag of the tail segment. The significant change of both structural and dynamical properties of unfolded Csp between highly denaturing and near-physiological conditions shows the importance of using single-molecule spectroscopy and kinetic experiments to study unfolded proteins. To benefit from the advantages of both techniques, a microfluidic mixer was developed to combine the resolution of single-molecule spectroscopy with the capability to populate states out of equilibrium with kinetic measurements. The continuous mixer design decouples the reaction process from the measurement time, enabling measurements for extended periods of times, as required for single-molecule detection. Refolding experiments of Csp could be performed with a dead time of about 5 ms and the folding rate was in good agreement with ensemble stopped-flow data. In addition, the system can be used to analyze non-equilibrium states and to monitor complex kinetic processes with the growing set of observables available from single-molecule measurements. Correlation analysis can give important insights into chain dynamics on the nanosecond timescale, but processes such as triplet state decay or translational diffusion contribute to the correlation signal on longer timescales, thus hampering the analysis of slower dynamical processes. Additionally, structural heterogeneity within subpopulations is often difficult to access with single-molecule spectroscopy, as the transfer efficiency peak representing a subpopulation is already broadened by shot noise. In order to investigate both structural heterogeneity and slower dynamical processes, a new analysis method was developed, which uses the information of freely diffusing molecules detected a second time, i.e. after they recur to the confocal volume after a first passage. Recurrence analysis of single particles (RASP) can extend the time window available for single molecules in diffusion by more than a factor of ten. The additional information can be employed to extract shot noise- broadened peak shapes and positions, even when subpopulations strongly overlap or when they are only marginally populated. The knowledge of the shot noise width allows the identification of heterogeneity that contributes to peak widths within one subpopulation. Interconversion between subpopulations can be monitored and the corresponding rates can be determined if the process occurs on time scales between hundreds of microseconds and tens of milliseconds. RASP was used to directly observe structural heterogeneity of proline peptides in aqueous buffer and of the unfolded state of Csp in ethylene glycol, with subspecies interconverting on the tens of millisecond timescale and slower. The folding rates of spectrin R15 and the B domain of protein A at equilibrium could be determined in good agreement with stopped-flow and temperature jump data, respectively, showing the potential of RASP to provide quantitative information. Taken together, this work sheds new light on the structural and dynamical properties of unfolded Csp, especially under the most interesting conditions where the protein is mostly native. To this end, several new techniques were introduced to obtain more detailed information on subpopulations in heterogeneous systems. The range of conditions accessible for the analysis of the unfolded state could be extended by using microfluidic mixing, both with CD at lower wavelengths and with single-molecule FRET. The window to monitor dynamic processes could be extended to very short times (picoseconds timescale) by correlation analysis. For single-molecule spectroscopy in diffusion, RASP was introduced as a simple but very effective approach to detect structural heterogeneity in subpopulations and to study dynamical processes in the time range between hundreds of microseconds and tens of milliseconds. ZUSAMMENFASSUNG Der entfaltete Zustand gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit aufgrund der steigenden Zahl von Belegen für dessen Bedeutung für die Regulation, Funktion, Stabilität und Faltung von Proteinen. Die Untersuchung des entfalteten Zustandes wird erschwert durch dessen besondere Eigenschaften; so ist er durch eine Verteilung von schnell fluktuierenden Konfigurationen charakterisiert, die unter physiologischen Bedingungen nur schwach populiert sind. In der vorliegenden Arbeit werden zwei Strategien verwendet, um die speziellen Anforderungen der Untersuchung von entfalteten Proteinen zu erfüllen: Mit Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie kann der entfaltete Zustand auch in Anwesenheit des gefalteten Zustandes untersucht werden. Mit kinetischen Experimenten kann der entfaltete Zustand transient in interessanten Lösungsbedingungen populiert und untersucht werden, bevor die Rückfaltung startet. In den hier vorgestellten Experimenten werden die Eigenschaften des entfalteten Zustandes des Kälteschockproteins (cold shock protein, Csp) aus Thermotoga maritima in der Nähe physiologischer Bedingungen untersucht, wo in vorangegangenen Studien ein Kollaps des entfalteten Csps nachgewiesen werden konnte. Um die Auswirkungen auf den Faltungsprozess verstehen zu können, ist ein detailliertes Bild der kollabierten Struktur von großem Interesse. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Varianten von Csp hergestellt und mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, um Förster Resonanzenergietransfer nach Förster (FRET) in verschiedenen Bereichen innerhalb der Proteinmoleküle messen zu können. Mittels Einzelmolekül-FRET-Spektroskopie konnte nachgewiesen werden, dass die Abstände aller Varianten sehr gut mit dem Gaußschen Kettenmodel übereinstimmen, sowohl in Anwesenheit von hohen GdmCl-Konzentrationen als auch in der Nähe physiologischer Bedingungen. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass es keinen bevorzugten Kollaps in bestimmten Kettensegmenten gibt, sondern dass die Kompaktierung gleichmäßig über die gesamte Polypeptidkette stattfindet. Um den Anteil der Sekundärstruktur im entfalteten Zustand messen zu können, wurde ein Mikrofluidik-Mischsystem entwickelt, welches es ermöglicht, kinetische Experimente mit Synchrotronstrahlungs- Circulardichroismus (synchrotron radiation circular dichroism, SRCD) durchführen zu können. In Kombination mit SRCD erweitert diese Mischapparatur den zugänglichen Wellenlängenbereich bis auf 205 nm bei einer Totzeit von ca. 200 µs. Damit kann der Sekundärstrukturgehalt in kinetischen Experimenten untersucht werden, bei Wellenlängen und mit einer Zeitauflösung, die mit kommerziellen stopped-flow-Geräten nicht zugänglich sind. Die Leistung des Mischapparates konnte mit Messungen der Faltungskinetik von Cytochrom C gezeigt werden, welche eine gute Übereinstimmung mit bereits veröffentlichten Daten zeigten. Messungen von Csp ergaben einen µ-Strukturgehalt von 20% verglichen mit dem gefalteten Zustand. Diese Sekundärstuktur kann einen signifikanten Einfluss auf den folgenden Faltunsgprozess haben. Im Zusammenhang mit den Ergebnissen der Einzelmolekülmessungen sind diese Ergebnisse ein interessanter Beitrag zum reconciliation problem („Vereinbarungsproblem“), das heisst zu der Frage, wie die Beobachtungen von globalen Eigenschaften, die denen eines random coils (einer Irrflugskette) entsprechen, zu vereinbaren sind mit Nachweisen von Reststruktur in entfalteten Proteinen. Offensichtlich muss die Anwesenheit von Sekundärstruktur nicht die globalen Abstandsverteilungen von entfalteten Proteinen beeinflussen, nicht einmal in der Nähe physiologischer Bedingungen. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass die Strukturelemente eher kurze Kettenabschnitte umfassen und/oder nur sehr kurzlebig sind und daher die globale Abstandsverteilung nicht signifikant beeinflussen. Die Struktur von entfalteten Proteinen ist eng mit ihren dynamischen Eigenschaften verknüpft, da die Bildung von strukturellen Elementen das Zusammentreffen von verschiedenen Teilen der Kette bedingt. Die dynamischen Eigenschaften legen die Zeit fest, in der ein Protein seinen Konfigurationsraum austesten kann und sind somit essential für das Verständnis von entfalteten Proteinen und des Faltungsprozesses. Zu diesem Zweck wurden Fluoreszenzkorrelationsfunktionen in Anwesenheit von gefalteten Molekülen mit einer Zeitauflösungen von unter einer Nanosekunde gemessen. Die Totzeiten der einzelnen Detektoren konnten mittels eines Hanbury Brown und Twiss Aufbaus umgangen werden. Die Analyse der Photonenstatistik ergab eine globale Rekonfigurationszeit der entfalteten Polypeptidkette von ca. 50 ns für stark denaturierte Proteine, die mit Abnahme der GdmCl Konzentration ansteigt. Da die intramolekularen Abstände aus der Analyse der Transfereffizienten verfügbar sind, konnte der relative Diffusionskoeffizient D der kettenenden ebenfalls ermittelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass D mit zunehmender Kettenkompaktierung nahe physiologischer Bedingungen abnimmt. Diese Abnahme kann mit einer Zunahme von intramolekularen Wechselwirkungen aufgrund von Veränderungen der Dichte und Interaktionen des Polypeptid-Rückgrats sowie der Seitenketten interpretiert werden. Ein Beispiel solcher Interaktionen könnte die Bildung von Sekundärstruktur sein, wie sie in den SRCD-Experimenten nachgewiesen wurde. Die intramolekularen Diffusionskoeffizienten von Csp stimmen sehr gut mit denjenigen von kurzen, unstrukturierten Peptiden überein, was auf die Abwesenheit von starken und spezifischen Wechselwirkungen schließen lässt und damit verbundenen größeren Energiebarrieren im kollabierten entfalteten Zustand von Csp. Messungen der verschiedenen Csp Varianten mit unterschiedlichen intramolekularen Abständen ergaben eine Abnahme von D mit abnehmendem Abstand innerhalb der Kette, welche möglicherweise von einem viskosen Widerstand des überhängenden Kettenabschnitts verursacht wird. Die deutlichen Änderungen der strukturellen und dynamischen Eigenschaften von entfaltetem Csp zwischen stark denaturierenden und annähernd physiologischen Bedingungen verdeutlichen, wie wichtig Einzelmolekülspektroskopie und kinetische Experimente für die Untersuchung entfalteter Proteine sind. Um von den Vorteilen beider Methoden zu profitieren wurde ein Mikrofluidik-System entwickelt, mit deren Hilfe Einzelmolekülmessungen in nicht-Gleichgewichtsexperimenten durchgeführt werden können. Durch die kontinuierliche Mischanordnung können längere Messungen zu bestimmten Zeiten der Reaktion durchgeführt werden, wie sie für Einzelmolekül Experimente benötigt werden. Rückfaltungsexperimente mit Csp wurden mit einer Totzeit von ca. 5 ms gemessen und stimmen gut mit Stopped-Flow Ergebnissen im Ensemble überein. Insgesamt kann das System eingesetzt werden, um Zustände unter destabilisierenden Bedingungen zu messen oder um kinetische Prozesse zu verfolgen mit den diversen Parametern, die durch Einzelmolekülspektroskopie bestimmbar sind. Fluoreszenzkorrelationsexperimente ermöglichen wichtige Einblicke in die Kettendynamik auf der Nanosekunden-Zeitskala; schwieriger ist allerdings die Untersuchung langsamerer dynamischer Prozesse, da z.B. der Zerfall des Triplettzustandes der Farbstoffe und die Translationsdiffusion der Moleküle das Signal der Fluoreszenzkorrelation dominieren. Die Heterogenität innerhalb von Subpopulationen ist schwierig zu untersuchen, da die Transfereffizienzverteilungen, die einer Subpopulation entsprechen, bereits durch Schrotrauschen verbreitert werden. Um sowohl die strukturelle Heterogenität als auch langsamere dynamische Prozesse untersuchen zu können, wurde eine neue Analysemethode entwickelt, die die Information von Molekülen ausnutzt, die nach ihrer ersten Detektion ein weiteres Mal detektiert werden. Diese Analyse wiederkehrender Moleküle (Recurrence Analysis of Single Particles, RASP) erweitert das Zeitfenster, in dem einzelne Moleküle untersucht werden können, um eine Größenordnung. Die zusätzliche Information kann verwendet werden, um die genauen Schrotrausch-bedingten Peakformen und -positionen zu ermitteln, selbst wenn die Subpopulationen stark überlappen oder nur gering populiert werden. Mit Kenntnis der Schrotrausch-bedingten Breite kann Heterogenität innerhalb der Subpopulationen identifiziert werden, die ebenfalls zur Verbreiterung der Peaks beitragen kann. Umwandlungen zwischen den Subpopulationen können beobachtet und die zugehörigen Reaktionsraten bestimmt werden, sofern die entsprechenden Zeitkonstanten zwischen ca. 100 s und 20 ms liegen. RASP wurde erfolgreich eingesetzt, um strukturelle Heterogenität von Polyprolinpeptiden in wässrigem Puffer und von ungefaltetem Csp in Ethylenglykol zu charakterisieren, wobei die Subspezies sich mit Raten von 100 s-1 (Csp) und langsamer (Prolin-Peptide) ineinander umwandeln. Die Faltungsrate von Spektrin R15 und der B Domäne von Protein A konnten im Gleichgewicht bestimmt werden und stimmen gut mit Stopped-Flow Daten bzw. Temperatursprungdaten überein. Dies zeigt, dass RASP auch quantitative Ergebnisse liefern kann. Insgesamt ermöglicht die vorliegende Arbeit neue Einsichten in die strukturellen und dynamischen Eigenschaften von entfalteten Csp, insbesondere unter Bedingungen wo das Protein hauptsächlich in seiner nativen Form vorliegt. Dazu wurden mehrere Methoden entwickelt, um neue Information über Subpopulationen in heterogenen Gemischen zu erhalten. Der zur Verfügung stehende Zeitbereich, um entfaltete Zustände zu untersuchen, konnte durch Mikrofluidik-Mischsysteme erweitert werden, sowohl für CD-Messungen in niedrigeren Wellenlängenbereichen als auch für Einzelmolekül-Messungen. Der zur Verfügung stehende Zeitbereich, um dynamische Prozesse mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie zu untersuchen, konnte auf den Picosekunden-Bereich ausgedehnt werden. RASP wurde als einfache, aber doch sehr effiziente Methode eingeführt, um strukturelle Heterogenität in Subpopulationen zu charakterisieren sowie dynamische Prozesse in der Größenordnung zwischen 100 µs und 10 ms zu untersuchen