Contribution of ABC transporters to antiepileptic drug resistance in temporal lobe epilepsy

Temporallappenepilepsie (TLE) verbunden mit hippokampaler Sklerose ist eine weit verbreitete Erkrankung des Zentralnervensystems. Häufig ist bei dieser Form der Epilepsie die Behandlung der Anfälle durch eine so genannte Antiepileptika-Resistenz erschwert, wenn nicht gar gänzlich verunmöglicht. Die Ursachen dieser Pharmakoresistenz sind unklar. Eine Hypothese, die Transporter-Hypothese, besagt dass eine verstärkte Beseitigung von Antiepileptika aus dem epileptischen Fokus zu einer unzureichenden Medikamentenkonzentration führt. Der Abtransport der Medikamente an der Blut-Hirn Schranke (BHS) läuft vermutlich über sogenannte Multidrug-Transporter, vor allem der ABC-Transporter Familie. Es ist daher wichtig zu untersuchen, ob ein Antiepileptika ein Substrat für solche ABC-Transporter ist, um vorhersagen zu können, wie die Medikamente unter physiologischen wie auch pathologischen Bedingungen im Hirn verteilt sind. Dies ist die Grundlage, um zukünftig Medikamente mit verbesserter Penetration des Gehirns und stärkerer Wirksamkeit zu entwickeln. In dieser Arbeit wurde untersucht, welche Rolle Multidrug- Transporter der ABCB, sowie der ABCC Familie, in der Pharmakoresistenz gegen Antiepileptika spielen. Wir benutzten einen in vitro sowie einen in vivo Ansatz. Einerseits haben wir ein neuartiges in vitro BHS Modell entwickelt. Dieses besteht aus polarisierten Epithelzellen (MDCK Zellen) welche mit einer, mittels Doxycyclin induzierbaren, Expressionskassette für die humanen ABC-Transporter ABCB1 und ABCC1 stabil transfiziert wurden. Die Zellen bilden dichte Monolayers. Daher wird ein sogenanntes Zwei-Kompartiment-System mit zwei getrennten Hälften gebildet, wenn die Zellen auf einem Filtereinsatz wachsen. Der Zellrasen bildet dabei eine selektive Barriere. Nachdem monoklonale, stabil transfizierte Zelllinien erzeugt worden waren, wurden in diesem System Transportstudien durchgeführt. Zuerst verifizierten wir die induzierbare Expression und korrekte Lokalisation der rekombinanten Transporter mittels Western Blot und Antikörperfärbung der Zellen, dann überprüften wir die Funktionsfähigkeit, indem wir den Transport eines bekannten Substrats testeten. Für die Transportstudien wurde, eine bestimmte Zeit nach der Zugabe eines Stoffes in eines der Kompartimente, die Stoffmenge in den verschiedenen Kompartimenten mittels LC-MS/MS ermittelt. Durch den Vergleich des Transports in Zellen, welche den Transporter überexprimieren, mit dem in nicht-induzierten Zellen, wurde ermittelt, welchen Anteil die überexprimierten Transporter an den Gesamttransport haben. Für die beiden getesteten Antiepileptika Carbamazepin (CBZ) und Lamotrigin konnte kein Transport, weder durch ABCB1 noch durch ABCC1, gezeigt werden. Hieraus wurde geschlossen, dass beide entweder keine oder nur sehr schwache Substrate der getesteten humanen ABC-Transporter sind. Erstaunlicherweise wurde jedoch beobachtet, dass alle getesteten Substanzen, unabhängig von der Expression der induzierbaren ABC-Transporter, aktiv (da stärker bei 37°C als bei 4°C) durch die MDCK Zellen transportiert wurden und zwar in basolateral-nach-apikaler Richtung. Dies widerspiegelt wohl die physiologische Funktion der endothelen Nierenzellen, von denen die MDCK Zellen abstammen, und legt die Vermutung nahe die Folge von endogen exprimierten Transportern unterschiedlichen Typs zu sein. Im zweiten Ansatz testeten wir die Transporter-Hypothese der Pharmakoresistenz in vivo, in einem Medikamenten-resistenten Mausmodell der Temporallappenepilepsie. Dazu wurden wildtyp und knockout Mäuse, welchen die Gene für abcb1a fehlen, benutzt. Diese Mäuse wurden durch intrahippokampale Injektion von Kainat (KA) epileptisch gemacht. Nachdem intrahippokampale Elektroden implantiert worden waren, konnten die EEGs dieser Mäuse gemessen und analysiert werden. Der Effekt einer Injektion von unterschiedlichen Dosen von CBZ wurde mit dem Effekt des Trägerstoffs allein verglichen. Hierfür wurde die Anzahl und Dauer der Anfälle vor und nach den Injektionen analysiert. Alle Mauslinien zeigten drei Wochen nach der KA Injektion die charakteristischen Anfälle sowie eine hippokampale Sklerose. Wir fanden klare Unterschiede zwischen den verschiedenen getesteten Mausstämmen in der Anfallszahl, aber nicht in der Anfallslänge. Es schien auch so, als ob die Mäuse nach der Injektion von CBZ gehäuft interiktale Aktivität hätten. Nichtsdestotrotz konnte keine Beteiligung von Abcb1a an der CBZ-Resistenz nachgewiesen werden. Mittels Kombination der beiden Studien sollte die Gültigkeit der Transporter- Hypothese für die Antiepileptika-Resistenz überprüft werden. Die Resultate stützen die Hypothese nicht, da in vitro keine Beteiligung der humanen Proteine ABCB1 und ABCC1 am Transport von Antiepileptika gezeigt werden konnte, noch konnte in vivo bewiesen werden, dass das Maus-Homologon Abcb1a eine Rolle bei der Resistenz spielt. Zusammen mit ähnlichen Befunden von anderen Forschungsgruppen stellen diese Resultate die Relevanz der Transporter-Hypothese in Frage. Man muss annehmen, dass nicht nur ein Mechanismus für die Antiepileptika-Resistenz in Patienten verantwortlich ist, sondern dass verschiedene zusammenspielen, einschliesslich die Beseitigung von Medikamenten durch deren Abfuhr oder deren Metabolismus, sowie funktionale Veränderungen der Wirkungsorte. english Summary Temporal Lobe Epilepsy (TLE) with hippocampal sclerosis is a common adult seizure disorder, with resistance to antiepileptic drugs (AED) being a common limiting factor of its treatment. Pharmacoresistance might be due to enhanced AED removal from epileptogenic tissue at the blood-brain barrier (BBB) through over-expression of multidrug transporters, especially of the ABC transporter family. Hence, evaluation of the potential of an AED to be a substrate for ABC transporters located at the BBB will be crucial to understand its brain distribution under normal and pathological conditions and for future development of drugs with improved brain penetration. This work investigated the possible role of multidrug transporters of the ABCB and ABCC family in AED resistance using an in vitro and an in vivo approach. We have established a novel in vitro BBB model using inducible expression of the human ABC transporters ABCB1 and ABCC1 in stably transfected polarised epithelial cells (MDCK cells). These cells build tight monolayers, hence forming a selectively permeable barrier separating a basal from an apical compartment when grown on filter inserts in cell culture wells. Transcellular diffusion or transport, either facilitated or active, are required for a substance to cross from one compartment to the other. With this system, it is therefore possible to assess the substrate specificity of any recombinantly expressed transporter. Furthermore, inducible expression by doxycycline allows using non-induced cells as a control. Monoclonal lines, transfected with cDNA constructs, were selected using Western blotting and immunofluorescence to verify the level of overexpression and the correct subcellular localisation of the recombinant proteins. Transport was assessed by adding a compound of interest to one compartment and, after a certain incubation time at 37ºC, measuring its concentration in each compartment, as well as intracellularly by LC-MS/MS analysis. To distinguish between the action of the overexpressed transporter and endogenous transport mechanisms, experiments were performed in parallel with non-induced cells. In addition, control experiments were performed at 4ºC to inactivate energy-dependent processes. The two first-line AEDs carbamazepine (CBZ) and lamotrigine could not be demonstrated to be substrates of either ABCB1 or ABCC1 under the condition of our assay. This result led to the conclusion that both drugs are weak substrates at best, of these human ABC transporters. Surprisingly, we observed that all these drugs and other compounds tested were transported through the MDCK cells in basolateral to apical direction in a manner that was not influenced by the presence of the inducible ABC transporters. This feature might reflect the physiological function of epithelial kidney cells and is probably due to the expression of various endogenous transporters of various types. In a separate study, we tested the multidrug transporter hypothesis of pharmacoresistance in vivo in a mouse model of drug-refractory TLE. We used wild type mice and knockout mice lacking the abcb1a gene, which were rendered epileptic using intrahippocampal kainate (KA) injection. Occurrence of chronic recurrent seizures was determined by intrahippocampal EEG recordings. The efficacy of CBZ for suppressing seizures was compared to vehicle injection, by quantifying the frequency and duration of seizures before and after injection. All mouse lines displayed characteristic epileptic seizures combined with hippocampal sclerosis three weeks after KA injection. We found a marked strain-difference in seizure frequency but not seizure duration in response to CBZ. In addition, increased interictal activity was observed after CBZ injection. Despite these effects, an involvement of Abcb1a in resistance to CBZ could not be demonstrated unambiguously. By combining both approaches we aimed to assess the validity of the transporter hypothesis for AED resistance. Our results do not support the hypothesis, as no involvement in AED transport of human ABCB1 and ABCC1 was found in vitro, nor could the mouse homologue Abcb1a clearly be demonstrated to play a part in resistance to CBZ in vivo. Our results, together with comparable findings of other groups, questions the relevance of the multidrug transporter hypothesis. However, it is possible that multiple mechanisms, including extrusion and metabolism of drugs, and functional changes at drug targets, act together to result in drug resistance to a multitude of different AEDs