Functional characterization of a novel Xenopus polo-like kinase interacting protein

Summary Cell division is one of the most fundamental processes in biology. Meiosis is a specialized form of cell division resulting in cells capable of sexual reproduction. In higher animals male reproductive cells are called sperm cells, the female ones are called oocytes. The life cycle of a typical sexually reproducing organism includes a point where sperm and oocyte fuse to yield a diploid zygote, which develops into a new individual. This process is termed fertilization. The oocytes of most vertebrates are arrested at metaphase of meiosis II before fertilization. This is thought to prevent development in the absence of fertilization (parthenogenesis). In 1971 a biochemical activity was discovered that mediates this cell cycle arrest and was hence termed cytostatic factor (CSF). CSF inhibits a protein complex called the anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C). The APC/C is a ligase that covalently attaches the small protein ubiquitin to cell cycle regulatory proteins in order to target them for proteolytic degradation. This results in ordered cell cycle progression. After fertilization of CSF-arrested oocytes calcium triggers the APC/C-dependent destruction of anaphase inhibitors like cyclin B or securin. This allows for progression beyond metaphase of meiosis II, pronuclear fusion and the subsequent onset of embryonic development. Studies in Xenopus egg extract have shown that the protein kinase Plx1 of the polo-like kinase family is also required for this process. This work has begun to characterize the protein XErp1, which has been found as interacting partner of Plx1. Function and regulation of XErp1 have been investigated in Xenopus egg extracts and oocytes. Inhibition of XErp1 in CSF-arrested Xenopus egg extracts has shown that the protein is required to maintain CSF arrest. Consistently, overexpression of XErp1 leads to an inability of the extract to activate the APC/C after a calcium stimulus which prevents metaphase to anaphase transition. These results suggested that XErp1 might be a direct inhibitor of the APC/C. Indeed, a carboxy-terminal domain of XErp1 was found to be able to directly inhibit the ubiquitin ligase activity of immuno-purified APC/C. Experiments examining the regulation of XErp1 have shown that the protein is degraded rapidly after calcium stimulation. This degradation could be shown to be dependent on a phosphorylated degradation signal in the amino-terminus of XErp1. Furthermore, it was shown that Plx1 phosphorylates the two serine residues 33 and 38 within this motif in vitro. Together these results lead to a mechanistic model of APC/C activation associated with release from CSF arrest. According to this model, Plx1-dependend phosphorylation of XErp1 leads to its destruction and therefore derepression of the APC/C.Zusammenfassung Zellteilung ist einer der fundamentalsten biologischen Prozesse. Die Meiose ist eine spezielle Art der Zellteilung, die der Produktion von zur geschlechtlichen Fortpflanzung befähigten Zellen dient. Bei höheren Tieren bezeichnet man die männlichen Geschlechtszellen als Spermien und die weiblichen als Eizellen. Im Lebenszyklus eines typischen höheren Organismus verschmelzen Spermium und Eizelle und ergeben eine Zygote, die den Ausgangspunkt für die Entwicklung eines neuen Individuums bildet. Diesen Prozess nennt man Befruchtung. Die Eizellen der meisten Wirbeltierspezies sind vor der Befruchung in der Metaphase II des meiotischen Teilungszykluses blockiert, um eine Entwicklung ohne vorherige Befruchtung (Parthenogenese) zu verhindern. Dieser Arrest wird von einer 1971 entdeckten biochemischen Aktivität verursacht, die man als zytostatischen Faktor (engl. cytostatic factor, CSF) bezeichnet hat. Der zytostatische Faktor inhibiert einen Proteinkomplex, den man „anaphase-promoting complex/cyclosome“ (APC/C) nennt. Der APC/C ist eine Ligase die das kleine Protein Ubiquitin kettenförmig an andere Zellzyklus-regulierende Proteine koppelt und diese damit für den proteolytischen Abbau markiert. Der durch ein Kalziumsignal induzierte, APC/C-abhängige Abbau von Anaphase Inhibitoren wie Zyklin B und Securin ist nötig, damit die Zelle den Metaphase-Anaphase Übergang der Meiose II nach Befruchtung vollziehen kann. Desweiteren, haben Untersuchungen in Eiextrakten des Krallenfrosches Xenopus laevis gezeigt, dass die Proteinkinase Plx1 für die Aktivierung des APC/C am Metaphase-Anaphase Übergang nötig ist. Diese Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung des Proteins XErp1, dass als Bindungspartner von Plx1 identifiziert wurde. Die Untersuchungen zur Funktion und Regulation von XErp1 wurden in Xenopus Eiern und deren Extrakten durchgeführt. Durch Inhibition der XErp1 Funktion in CSF-blockierten Eiextrakten konnte gezeigt werden, dass XErp1 essentiell für die Aufrecherhaltung des zytostatischen Faktor Arrestes ist. Im Einklang mit diesen Daten führt die Überexpression von XErp1 zu einer Situation, in der das Kalziumsignal den APC/C nicht mehr aktivieren kann und dem zu Folge der Metaphase-Anaphase Übergang verhindert wird. Diese Ergebnisse deuten an, dass XErp1 ein Inhibitor des APC/C sein könnte. Tatsächlich wurde gefunden, dass eine carboxy-terminale Domäne von XErp1 in der Lage ist, die Ubiquitylierungsaktivität von immun-gereinigtem APC/C in vitro direkt zu inhibieren. Experimente zum Verhalten und zur Regulation von XErp1 haben gezeigt, dass XErp1 selbst unmittelbar nach dem Kalziumsignal abgebaut wird. Dieser Abbau hängt von einem Sequenzmotiv im amino-Terminus von XErp1 ab, das durch Phosphorylierung aktiviert wird. Es konnte im Folgenden gezeigt werden, dass Plx1 die Phosphorylierung an den Serinresten 33 und 38 in diesem Sequenzmotif in vitro ausführen kann. Zusammen führen diese Ergebnisse zu einem mechanistischen Modell der APC/C Aktivierung, welche zur Auflösung des zytostatischen Faktor Arrestes führt. Hiernach führt die Phosphorylierung des APC/C Inhibitors XErp1 durch Plx1 nach Befruchtung zu dessen Abbau und damit zur Aktivierung des APC/C