Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der Proteintranslokasen der mitochondrialen Innenmembran von Neurospora crassa und Saccharomyces cerevisiae

Die Innenmembran von Mitochondrien besitzt zwei Translokasen für den Import von Proteinen. Der TIM23-Komplex vermittelt die Translokation über und in die Innenmembran, der TIM22-Komplex inseriert Proteine mit mehreren hydrophoben Segmenten in die Innenmembran. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Komponenten dieser Translokationsmaschinerien in N. crassa und S. cerevisiae identifiziert und charakterisiert werden. In N. crassa waren zu Beginn der Arbeit im Vergleich zu S. cerevisiae nur wenige Komponenten der TIM-Translokasen bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Proteine Tim22, Tim54 und Tim44 in N. crassa identifiziert. Dies wurde entweder durch die Verwendung degenerierter Primer in PCR-Reaktionen mit cDNA aus N. crassa oder durch Durchmustern von Datenbanken erreicht. Die identifizierten Proteine des TIM22-Komplexes wurden bezüglich ihrer Lokalisation und Topologie untersucht. Es handelt sich bei Tim22 um ein Membranprotein der inneren mitochondrialen Membran mit vier Transmembranhelices, das sowohl den N- als auch den C-Terminus in den Intermembranraum exponiert. Tim54 ist ebenso in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert und besitzt nur eine Transmembranhelix. Der größte Teil des Proteins liegt im Intermembranraum, nur wenige Aminosäurereste befinden sich in der mitochondrialen Matrix. Ferner wurde der TIM22-Komplex von N. crassa charakterisiert. Dazu zählten die Untersuchungen der beteiligten Komponenten, der Komplexgröße und der Stabilität des Komplexes. In N. crassa besteht der TIM22-Komplex aus den Komponenten Tim22, Tim54, Tim9 und Tim10, die einen etwa 350 kDa großen Komplex bilden. Für spätere funktionelle Untersuchungen wurde der TIM22-Komplex bzw. Tim22 alleine gereinigt. Beides wurde in Lipidvesikel rekonstituiert. Dieses Verfahren bietet die Grundlage für Untersuchungen in einem definierten experimentellen System, wie Proteine der Carrier-Familie in Lipidmembranen inseriert werden. In S. cerevisiae wurde mit Tim16 eine neue Komponente des mitochondrialen Importmotors des TIM23-Komplexes identifiziert. Dies konnte durch Koreinigung mit einer weiteren Komponente des Importmotors, Tim14, erreicht werden. Die strukturelle Vorhersage für Tim16 ähnelt stark der des J-Proteins Tim14. Tim16 fehlt allerdings das für die Funktion von J-Proteinen essentielle HPD-Motiv. Tim16 ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und peripher mit der inneren mitochondrialen Membran assoziiert. Durch Depletion von Tim16 wird der Import von Substraten in Mitochondrien beeinträchtigt, die vom mitochondrialen Importmotor abhängig sind. Durch Koimmunopräzipitationen und Quervernetzungsexperimente wurde Tim16 als neue Komponente des mitochondrialen Importmotors der TIM23-Translokase definiert. Funktionell spielt Tim16 eine große Rolle für die Integrität des Importmotors. Die genaue Struktur des Importmotors, seine Regulation und dessen Dynamik im Zuge der Translokation von Präproteinen muss in zukünftigen Experimenten geklärt werden