STAT1 as a central mediator of inflammation and vascular dysfunction

Wydział Biologii: Instytut Biologii Molekularnej i BiotechnologiiCytokina pro-zapalna interferon-gamma (IFNγ) oraz receptor Toll-podobny 4 (TLR4) współdziałają w leukocytach powodując zwiększoną odpowiedź zapalną: znaczny wzrost ekspresji chemokin i cytokin. Stawiamy hipotezę, że podobny mechanizm występuje w komórkach śródbłonka (EC) i mięśni gładkich (SMC). Zakładamy, że odpowiada za to zwiększona aktywacja czynnika transkrypcyjnego STAT1 oraz jego interakcja z czynnikami IRF i NFκB. W rozdziale drugim udowodniono, że wspomniane powyżej zjawisko współdziałania IFNγ i TLR4 występuje w komórkach EC i SMC, powodując znacznie zwiększoną adhezję monocytów do komórek EC, co jest jednym z pierwszych procesów w trakcie tworzenia płytki miażdżycowej. Przedstawiono dowody na zależność tego mechanizmu od STAT1 poprzez użycie inhibitora STAT1 - fludarabiny. W rozdziale trzecim dostarczono kolejnych argumentów na istnienie współdziałania szlaków przekazywania sygnałów IFNγ i TLR4. Analiza danych z płytek wieńcowych i szyjnych wykazała znaczny wzrost ekspresji genów pro-zapalnych i modulujących odpowiedź immunologiczną. Geny, których ekspresja ulega zwiększeniu są chemokinami, cytokinami, cząsteczkami adhezyjnymi i metaloproteazami. Wszystkie te białka są zaangażowane w proces tworzenia płytek miażdżycowych. Rozdział czwarty prezentuje poszukiwania nowych inhibitorów białka STAT1, o potencjalnym zastosowaniu w leczeniu miażdżycy. Wykorzystując komputerowe metody badań wytypowano listę 12 potencjalnych inhibitorów aktywności STAT1. Następnie związki przetestowano in vitro w modelu komórek EC. Wykazano, że fludarabina, dotychczas uważana ze specyficzny inhibitor STAT1, hamuje również aktywność białka STAT3. Podobnie, wśród badanych związków trzy wykazały aktywność inhibicyjną, jednak żaden z nich nie był w pełni specyficzny. Porównanie sekwencji domen SH2 białek STAT1 i STAT3 pozwoliło na opracowanie nowej strategii poszukiwań specyficznych inhibitorów STAT1, która jest w trakcie realizacji. Podsumowując, niniejsza praca przyniosła nowe odkrycia w dziedzinie biologii płytki miażdżycowej. Zaprezentowano nowy mechanizm dysfunkcji EC oraz przedstawiono informacje świadczące o współdziałaniu IFNγ i TLR4 w płytkach miażdżycowych pacjentów. Badania nad inhibitorami STAT1 pozwoliły na opracowanie nowej strategii poszukiwania takich związków. Owocem badań jest również projekt mający na celu opracowanie nieinwazyjnego testu diagnostycznego wykrywającego zmiany miażdżycowe.IFNγ-TLR4 signal integration has been studied in immune cells. Since atherosclerotic plaque formation involves, more importantly, endothelial cells (ECs) and smooth muscle cells (SMCs) we want to investigate the possible presence of this mechanism in these. We would also like to explain the molecular basis of this crosstalk, as well as investigate possible ways to diagnose and treat atherosclerosis. We show (Chapter 2) that the crosstalk between IFNγ and TLR4 in ECs and SMCs results in amplified expression of pro-inflammatory chemokine CXCL10 and adhesion molecule ICAM1 and causes STAT1-dependent increase in monocyte to EC adhesion. We present a novel mechanism of EC dysfunction and possibly atherosclerotic plaque development. In Chapter 3 we show that in human plaques a significant increase in expression of pro-inflammatory and immunomodulatory genes takes place. These genes could possibly be regulated by STAT1 since STAT1 binding elements are over-represented in their promoters. We also provide evidence for possible complex interactions between STAT1 and IRFs or NFκB, producing a specific atherosclerotic signature that could serve as basis of a diagnostic assay. Further we investigate the possibility of developing specific STAT1 inhibitors to treat atherosclerosis (Chapter 4). We present evidence for lack of specificity of the only known STAT1 inhibitor, fludarabine. By applying in silico methods we develop and test in vitro a new potential STAT1 inhibitor, which we have shown to be unspecific as well. Finally, we develop and present a new strategy to find specific STAT1 inhibitors. Chapter 5 is a summary of presented work on a background of the current state-of-the-art. We present ideas for future research directions in the field of plaque biology, as well as our current undertakings, which include development of a novel atherosclerosis diagnostic assay and novel, specific STAT1 inhibitors